miR-142-3p抑制甲狀腺癌細胞增殖的研究

余明軍，王海明

(杭州市第三人民醫院 外科，浙江 杭州 310009)

甲狀腺癌是常見的內分泌惡性腫瘤[1]，近年來發病率持續增長，為女性腫瘤發病率第1位，男性腫瘤發病率第2位[2]。大部分甲狀腺癌在手術切除結合碘131及甲狀腺素治療后可達到臨床治愈，但仍存在5%的5年復發率[3]。MicroRNA(miRNA)是一類長約21～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，在癌癥的發生發展中扮演著重要角色。研究表明，miR-142-3p在宮頸癌、腎癌、急性白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、肝細胞癌、鼻咽癌、骨肉瘤、食管癌、胰腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤中均存在異常表達[4-8]，并且miR-142-3p可直接靶向細胞周期蛋白CDC25C，促癌基因HMGB1、TGFβR1，及多種干細胞表面特異分子如CD133、Lgr5、ABCG2，調控腫瘤細胞增殖、侵襲、周期、凋亡等。Jahanbani等[9]證實miR-142-3p在甲狀腺癌組織中低表達。本研究檢測甲狀腺癌細胞及正常甲狀腺細胞中miR-142-3p 的表達水平，研究miR-142-3p 對甲狀腺癌細胞增殖能力、單克隆形成能力及細胞周期的影響，以期為甲狀腺癌早期診斷、預測復發及尋找新治療靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 Real-time PCR 試劑盒購自上海欣百諾生物工程有限公司，RPMI1640 培養基、DMEM 培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，miR-142-3p mimics、miR-142-3p inhibitor、NC mimics購自上海吉瑪制藥技術有限公司，脂質體LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司，MTT溶液、DMSO溶液、流式周期檢測試劑盒購自美國Sigma公司，兔抗人Anti-Cyclin D1購自美國AbCam 公司，鼠抗人β-actin購自美國Epitomics公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 人甲狀腺癌細胞K1、TPC-1、BCPAP和人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1均購自中科院上海細胞庫。K1細胞在含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10% FBS的DMEM培養基中培養，TPC-1、BCPAP和Nthy-ori 3-1細胞在含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10% FBS的RPMI1640培養基中培養，于37℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養。

1.3 miR-142-3p的RT-PCR檢測 根據說明書步驟操作，收集對數生長期的K1、TPC-1、BCPAP和Nthy-ori 3-1細胞，加入適量Triozl 細胞裂解液提取RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度，定量后用DEPC水稀釋至500 ng/μL，合成cDNA。以GAPDH為內參，正向引物：5’CATGAGAAG TATGACAACAGCCT3’，反向引物：5’AGTCCTTCCAC GATACCAAAGTT3’；miR-142-3p上游引物為：5’ACA CTCCAGCTGGCTGTAGTGTTTCCTACT3’。miR-142-3p相對定量用2-△△CT計算。

1.4 細胞轉染 取對數生長期的K1細胞接種于6 孔細胞培養板中，培養至細胞單層密度達到50%～60%時，按照LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑說明書步驟進行轉染。陰性對照組(NC)、miR-142-3p mimics組和miR-142-3p inhibitor組分別轉染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor，轉染完成后繼續培養。

1.5 MTT 實驗 轉染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后，收集細胞接種于96孔細胞培養板中，初始細胞數為1 500個/孔，每組設置4個復孔。設置24、48、72、96、120 h 5個時間點。避光條件下，每孔加入MTT 溶液20 μL(5 mg/mL)孵育4 h后終止培養。負壓吸引器小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床上低速振蕩10 min使結晶充分溶解。酶聯免疫檢測儀檢測各孔490 nm的吸光度(OD值)，計算平均值并繪制細胞增殖曲線。

1.6 克隆形成實驗 轉染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后收集細胞，各組細胞按500個/孔接種于6孔板中，每組設置3個復孔。每孔補足完全培養基至1.5 mL，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養7～10天，每2～3天更換新鮮培養基。當6孔板中出現肉眼可見的細胞克隆時終止培養，用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，通風處風干。0.1%結晶紫溶液染色20 min，沖洗風干后拍照。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期 轉染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后，用0.25%無EDTA的胰酶消化收集細胞，用PBS重懸離心后加入預冷的75%乙醇，4℃固定過夜。加入400 μL 0.05 g/L PI，室溫避光孵育30 min后混勻，流式細胞儀上機檢測。

1.8 Western blot實驗 轉染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 48 h后收集細胞，加入80～100 μL裂解液，冰上裂解30 min后，12 000 rpm(離心半徑13.5 cm)，4℃離心30 min。上清液蛋白定量后，加入5×loading buffer，沸水浴15 min使蛋白變性。樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后200 mA轉膜1 h。硝酸纖維素膜蛋白面向上放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫于搖床低速搖動，封閉1 h。加入一抗，4 ℃避光孵育過夜，一抗稀釋倍數：Cyclin D1(1∶5 000)，β-actin(1∶1 000)。PBST洗滌NC膜后加二抗室溫避光孵育2 h。PBST洗膜3次后，NC膜蛋白面朝下上機掃描，應用Odyssey 蛋白質分析成像系統顯像，通過獲取目的條帶的灰度值作為表達強度。

1.9 統計學分析 應用 SPSS 22.0統計軟件，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-142-3p表達檢測 RT-PCR結果顯示，miR-142-3p在甲狀腺癌細胞K1、TPC-1、BCPAP中的相對表達量分別為1.228±0.127、1.688±0.105、1.974±0.173，甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1中miR-142-3p的相對表達量為2.842±0.144。甲狀腺癌細胞K1、TPC-1、BCPAP中的miR-142-3p相對表達量均低于甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，差異均有統計學意義(P<0.05)。3種甲狀腺癌細胞中K1 細胞的miR-142-3p表達量最低。見封三圖1。

2.2 miR-142-3p對細胞增殖的影響 甲狀腺癌細胞K1轉染后24 h，NC組、miR-142-3p mimics組和miR-142-3p inhibitor組的OD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。從轉染后48 h開始，3組細胞增殖能力開始出現差異。轉染后120 h，與NC組OD值(0.820 5±0.025 5)相比，miR-142-3p mimics組細胞OD值(0.559 0±0.013 5)降低，miR-142-3p inhibitor組細胞OD值(1.116 5±0.029 3)增加，差異均有統計學意義(P<0.001)。見圖1。

***與NC組比較，P<0.001。圖1 miR-142-3p對甲狀腺癌細胞K1增殖能力的影響Figure 1 Effect of miR-142-3p on proliferation of thyroid cancer cell line K1

2.3 miR-142-3p對細胞單克隆形成的影響 甲狀腺癌細胞K1轉染后，miR-142-3p mimics組細胞克隆形成少于NC組，且單個克隆小于NC組；miR-142-3p inhibitor組細胞克隆形成多于NC組，且單個克隆大于NC組。見封三圖2。

2.4 miR-142-3p對細胞周期的影響 甲狀腺癌細胞K1轉染后，流式細胞術檢測結果顯示，NC組G0/G1期細胞百分比為(61.18±2.09)%，miR-142-3p mimics組G0/G1期細胞百分比為(74.89±2.09)%，miR-142-3p inhibitor組G0/G1期細胞百分比為(52.07±2.76)%，miR-142-3p mimic組G0/G1期細胞百分比高于NC組，miR-142-3p inhibitor組G0/G1期細胞百分比低于NC組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見封三圖3A。Western blot實驗結果顯示，與NC組相比，miR-142-3p mimics組Cyclin D1蛋白表達量下降，miR-142-3p inhibitor組Cyclin D1蛋白表達量升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見封三圖3B。

3 討論

研究表明，甲狀腺癌組織中存在microRNA的差異表達[9-11]。甲狀腺腫瘤microRNA表達譜的改變可作為生物學標志用于早期診斷，修復或抑制microRNA在甲狀腺癌細胞中的表達有可能為開發抗腫瘤藥物提供新思路。

現有研究[4-9]表明，miR-142-3p在包括甲狀腺癌在內的多種癌癥中表達下調，但其在甲狀腺癌中的作用機制尚不明確。本研究采用RT-PCR檢測人甲狀腺癌細胞株和正常甲狀腺細胞中miR-142-3p的表達水平，結果表明miR-142-3p在甲狀腺癌細胞K1、TPC-1、BCPAP中表達明顯降低，與Jahanbani等[9]研究結果相吻合，提示miR-142-3p在甲狀腺癌細胞中發揮抑癌基因的作用。轉染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor的K1細胞經MTT 法及克隆形成實驗檢測，miR-142-3p mimics 組細胞增殖減慢，單克隆形成減少，而miR-142-3p inhibitor組細胞增殖增強、單克隆形成增加，說明高表達miR-142-3p可以明顯抑制K1細胞的增殖能力。細胞周期實驗及Western Blot對Cyclin D1蛋白的檢測結果表明，外源性升高miR-142-3p的表達后，Cyclin D1表達被抑制，K1細胞被阻滯于G0/G1期。本研究結果提示，miR-142-3p在甲狀腺癌中發揮抑癌基因的作用，通過抑制Cyclin D1的表達抑制細胞分裂，進而抑制細胞增殖，對癌細胞侵襲遷移能力的影響還有待進一步實驗。

綜上所述，miR-142-3p 在甲狀腺癌細胞中呈低表達，高表達miR-142-3p可有效抑制甲狀腺癌細胞的增殖能力，通過抑制Cyclin D1表達將細胞阻滯在G0/G1期。