miRNAs指標在非小細胞肺癌患者血清中的表達及臨床意義

王佩瑾，林赟羽

(寧海縣第一醫院 呼吸科，浙江 寧波 315600)

非小細胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌病理學亞型，主要有腺癌(AC)和鱗狀細胞癌(SCC)[1]。早期準確診斷對NSCLC患者的治療十分重要[2]。miRNAs對細胞發育、分化、增殖和凋亡等生物學和病理學過程有重要影響，在腫瘤中可作為致癌基因(onco-miRNA)和腫瘤抑制miRNA[3-4]。無細胞miRNAs在體液(血漿、血清和尿液等)中可穩定存在，顯示了miRNAs作為腫瘤早期診斷標志物的潛力[5-6]。本研究旨在評估5種miRNA(miR-21-5p，miR-30a-5p，miR-126-3p，miR-210-3p，miR-486-5p)在NSCLC患者血清樣本中的表達水平及其診斷能力，以期為NSCLC的早期診斷提供依據。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—2013年3月于寧海縣第一醫院治療的符合中國原發性肺癌診療規范(2015年版)[7]診斷標準的原發性NSCLC患者50例，納入標準：①均經細胞學檢查或病理組織學明確診斷為NSCLC；②均未接受過抗腫瘤治療，包括放療、化療、手術及靶向治療等。排除患有其他系統疾病患者及孕婦、哺乳期女性患者。NSCLC患者中男38例，女12例；平均年齡(65.9±2.3)歲；根據美國癌癥聯合委員會第7版原發腫瘤局部淋巴結遠處轉移分期(TNM)[8]對NSCLC組分類：AC患者14例，SCC患者30例，6例患者腫瘤成分復雜；T1期7例，T2期28例，T3期10例，T4期5例。另選取29例健康個體為健康對照組，其中男23例，女6例；平均年齡(70.1±3.0)歲。本研究經醫院倫理委員會批準，所選患者均簽署知情同意書。

1.2 血清miRNA水平檢測 空腹取靜脈血約5 mL于無菌EDTA抗凝管中，室溫下靜置30～60 min，1 300 g離心10 min，取血清于-80 ℃保存。取血清1 mL加入Trizol 提取總RNA。采用逆轉錄和實時熒光定量PCR法，檢測血清中5 種miRNA表達。逆轉錄程序：在去核酶PCR 薄管中加入反應物，

充分混合3～5 s，70℃ 孵育5 min，迅速放入冰中冷卻。再加入其他反應物充分混勻，短暫離心，42℃ 孵育90 min，70℃ 加熱10 min，冷卻終止反應。擴增基因片段：95℃預變性1 min，95℃ 15 s、60℃ 20 s、70℃ 25 s，40個循環，然后95℃延伸反應20 s。以U6作為內參，采用 2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0統計學軟件。采用Shapiro-Wilk檢驗正態分布，通過Levene檢驗檢查方差的同質性。組間計量資料比較采用t檢驗，采用Pearson相關系數檢驗miRNA水平之間關聯性，采用Cox比例風險模型評估miRNA水平和患者總生存時間(OS)的關系，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者血清miRNA表達 與健康對照組比較，NSCLC組患者血清中的miR-21-5p、miR-30a-5p和miR-126-3p下調，miR-210-3p和miR-486-5p上調，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

與健康對照組比較，**P<0.01,***P<0.001。圖1 NSCLC患者血清miRNA表達水平Figure 1 Serum miRNA expression in patients with NSCLC

2.2 不同病理特征NSCLC患者miRNA水平 比較5種miRNA 在NSCLC腺癌和鱗狀細胞癌中的表達水平，miR-210-3p在NSCLC腺癌和鱗狀細胞癌患者血清中的水平差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同病理特征NSCLC患者miRNA水平Table 1 MiRNA levels in NSCLC patients with different pathological features

2.3 miR-210-3p對NSCLC腺癌的診斷價值 MiR-210-3p對NSCLC腺癌的ROC曲線下面積為0.84(95%CI: 0.72～0.96)，敏感度為86%，特異度為79%，見圖2。

圖2 miR-210-3p對NSCLC腺癌診斷的ROC曲線Figure 2 ROC curve of miR-210-3p for NSCLC adenocarcinoma

2.4 miRNA水平與總生存時間的關系 NSCLC組中17名患者總生存時間數據缺失，對33名NSCLC患者進行分析。結果顯示，調整性別、年齡和吸煙時間因素后，NSCLC患者miR-210-3p水平與總生存時間相關(P=0.03)。見表2。

表2 NSCLC患者miRNA水平與總生存時間的關系(n=33)Table 2 Relationship between miRNA level and overall survival in NSCLC patients(n=33)

3 討論

研究[9]表明，缺氧條件下miR-210-3p在多種癌癥中表達上調，其可能作為致癌基因和腫瘤抑制因子。本研究結果顯示，miR-210-3p在NSCLC患者血清中表達明顯上調。先前報道[10-11]指出，miR-210-3p在NSCLC患者血清和血漿樣品中上調，與本研究結果一致。另外，本研究結果顯示，與鱗狀細胞癌相比，NSCLC腺癌miR-210-3p表達明顯上調，miR-210-3p對NSCLC腺癌的ROC曲線下面積為0.84。Shen 等[12]研究結果表明，miR-210-3p診斷腺癌比診斷鱗狀細胞癌具有更高的敏感度。本研究結果表明，血清miR-210-3p與NSCLC患者總生存時間存在潛在關聯。早期研究[13]表明，miR-210-3p在NSCLC組織中的高表達與更長的存活率相關。而另一項研究[14]觀察到，腺癌組織中miR-210的高表達是縮短腺癌患者無病生存期的獨立預后因素，相關結果還需進一步大樣本驗證。

以往研究[15-16]顯示，與健康對照組相比，miR-126-3p在NSCLC患者中表達水平下調[16]，可作為NSCLC潛在的血液生物標志物，與本研究結果一致。研究[17]報道，miR-30a-5p在NSCLC患者血清中明顯上調，但在癌組織樣品中表現出上調，本研究結果顯示，miR-30a-5p在NSCLC患者血清中明顯下調。此外，miR-21-5p在NSCLC患者血清樣本中下調，與Abdollahi等[18]研究結果一致，該研究顯示NSCLC患者中miR-21-5p顯著升高，且與腫瘤分期相關。本研究結果顯示miR-486-5p在NSCLC患者血清中上調，而Shen等[12]報道miR-486-5p在NSCLC患者血清中下調，且與NSCLC患者的總生存時間相關。另有研究[19]報道miR-486-5p的高表達可作為一種優化預后因子，而Li等[20]的研究則表明miR-486-5p表達上調與不利生存相關。

綜上，本研究結果顯示miR-21-5p、miR-30a-5p、miR-126-3p、miR-210-3p和miR-486-5p在NSCLC患者血清中表達水平改變。miR-210-3p對NSCLC腺癌有一定的診斷價值，后續需進行大樣本量驗證。