HLA-G、Wnt5a和β-catenin蛋白在重度子癇前期胎盤組織中的表達(dá)及臨床意義

萬莉萍，張雪梅，萬虹利，高春元，關(guān)小紅

(1.成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，四川 成都 610100；2.四川省交通運輸廳公路局醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610097；3.同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院婦產(chǎn)科，上海 200129)

子癇前期屬于妊娠高血壓疾病的一種，指懷孕前血壓正常，妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等癥狀的妊娠期特發(fā)性疾病[1]。調(diào)查研究[2-4]顯示，子癇前期的全球發(fā)病率為5%～7%，國外發(fā)病率為2%～8%。重度子癇前期是子癇前期發(fā)病的重要階段，常引起孕婦心力衰竭、胎盤早剝、肺水腫，胎兒早產(chǎn)、生長受限等，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致孕婦和新生兒死亡[5-6]。目前，醫(yī)學(xué)界認(rèn)為子癇前期是由多因素、多通路的復(fù)雜機制所致，但具體發(fā)病機理尚未完全闡明。研究[7]顯示，母胎界面局部免疫系統(tǒng)耐受和滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降在子癇前期進(jìn)展過程發(fā)揮重要作用的，也是子癇前期發(fā)病機制的研究熱點。人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)屬非經(jīng)典性人類白細(xì)胞Ib類抗原分子，在母胎免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路是一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，在胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用。β-catenin介導(dǎo)Wnt經(jīng)典通路，Wnt5a介導(dǎo)Wnt非經(jīng)典信號通路，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、發(fā)育、黏附、組織代謝和遷移能力。因胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為類似于腫瘤細(xì)胞，故推測重度子癇前期的發(fā)生可能與β-catenin和Wnt5a蛋白的異常表達(dá)有關(guān)。本研究通過分析HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在重度子癇前期胎盤組織中的表達(dá)及定位情況，以期為臨床診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均自愿參與并簽署知情同意書。選取2017年8月至2020年8月成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科剖宮產(chǎn)分娩的80例重度子癇前期患者作為研究組。患者年齡22～42歲，平均(30.23±5.12)歲；孕周30～40周，平均(35.31±2.84)周。另選取同期80名剖宮產(chǎn)正常妊娠孕婦作為對照組。孕婦年齡23～42歲，平均(30.57±5.26)歲；孕周29～40周，平均(35.13±3.05)周。兩組研究對象在年齡、孕周比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。重度子癇前期的診斷參照《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，孕婦均為單胎、剖宮產(chǎn)分娩。排除多胎、冠心病、腫瘤、腦梗死、精神疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、先天性遺傳性疾病、生殖器官畸形或其他妊娠相關(guān)綜合征疾病(原發(fā)性高血壓、妊娠期糖尿病等)的孕婦。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 孕婦剖宮產(chǎn)分娩后，在無菌狀態(tài)下立即取其胎盤組織(胎盤母體面距臍帶附著處2～3 cm范圍內(nèi)剪取胎盤絨毛組織，應(yīng)避開鈣化灶、機化灶、出血灶等區(qū)域組織)，然后使用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗，并分割為1 cm×1 cm×1 cm的組織塊。一部分組織塊分裝于液氮保存，用于提取蛋白質(zhì)；另一部分組織塊保存于4%多聚甲醛，用于免疫組織化學(xué)實驗。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測Wnt5a和β-catenin蛋白水平 取胎盤組織約150 mg，提取并檢測蛋白濃度，上樣前將樣品于沸水中煮5 min，使蛋白變性后，采用12%十二烷基硫酸鈉聚-丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳來分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜。采用5%脫脂奶粉封閉2 h，小鼠抗人HLA-G單克隆抗體(稀釋比例1∶100，美國abcam公司)、兔抗人Wnt5a多克隆抗體(稀釋比例1∶500，美國Signalway公司)、兔抗人β-catenin多克隆抗體(稀釋比例1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司)4 ℃孵育過夜。用TBS-T洗滌膜3次，每次5 min。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(稀釋比例為1∶2 000，北京中杉金橋公司)和山羊抗兔IgG抗體(稀釋比例為1∶5 000，北京中杉金橋公司)孵育2 h，再用TBS-T洗滌膜3次，每次5 min，然后用TBS沖洗。采用增強型化學(xué)發(fā)光液(美國Thermo公司)進(jìn)行條帶顯色。用Image-ProPlus5.1圖像分析軟件對各蛋白條帶進(jìn)行分析，HLA-G以β-actin為內(nèi)參照，Wnt5a和β-catenin以GAPDH為內(nèi)參，計算各蛋白相對表達(dá)量。

1.2.3 免疫組化法檢測 HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的表達(dá)和定位情況 取出經(jīng)4%多聚甲醛固定后胎盤組織，常規(guī)行脫水、浸蠟、石蠟包埋及連續(xù)切片(厚0.3～0.4 μm)等操作。采用免疫組化檢測試劑盒(中國福州邁新公司)檢測組織中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的表達(dá)和定位情況。采用NIS-Elements軟件對圖像進(jìn)行采集，各圖片參數(shù)要求設(shè)置應(yīng)保持一致，以保證所采集的圖像具有可比性，并采用Image pro plus軟件進(jìn)行分析各蛋白的平均光密度水平。

1.2.4 臨床特征 兩組對象均于入院第1天測定入院平均動脈壓，留取孕婦入院當(dāng)天上午8∶00至次日8∶00的24 h尿液，應(yīng)用羅氏Cobas 501生化分析儀檢測24 h尿蛋白水平，并記錄孕婦妊娠胎兒出生體重。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組研究對象入院平均動脈壓、24 h尿蛋白、胎兒出生體重、蛋白質(zhì)印跡試驗中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的相對蛋白表達(dá)、免疫組化試驗中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的定位及平均光密度，分析HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白之間的關(guān)系及與患者臨床特征的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床特征比較

研究組孕婦入院平均動脈壓和尿蛋白水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而兩組胎兒出生體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組孕婦的臨床特征比較

2.2 兩組胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的相對表達(dá)情況比較

研究組胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的相對表達(dá)水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 兩組胎盤組織中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的相對表達(dá)情況比較

2.3 胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的定位情況

免疫組化結(jié)果顯示，HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在兩組胎盤組織中均有蛋白表達(dá)，其中HLA-G和β-catenin蛋白主要定位于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，Wnt5a蛋白主要定位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，見圖2。研究組胎盤組織HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的平均光密度水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的平均光密度水平比較

2.4 胎盤組織中HLA-G、Wnt5a與β-catenin的相關(guān)性分析

孕婦胎盤組織中HLA-G蛋白表達(dá)與Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.768,0.711；P<0.05)，Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.764，P<0.05)。見圖3。

2.5 胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白與患者入院平均動脈壓和尿蛋白的相關(guān)性分析

孕婦入院平均動脈壓水平與胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.537、-0.516、-0.498，P<0.05)，孕婦尿蛋白水平與胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)也均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.492、-0.457、-0.412，P<0.05)。見表4。

表4 胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白與患者入院平均動脈壓和尿蛋白之間的相關(guān)性分析

3 討論

免疫學(xué)認(rèn)為妊娠相當(dāng)于同種異體移植，維持母體和胎兒間的免疫平衡是成功妊娠的關(guān)鍵，一旦這種平衡失調(diào)，可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的異常浸潤、增殖，影響胎盤的正常形成和發(fā)育，從而誘發(fā)子癇前期等多種妊娠相關(guān)性疾病[11]。有研究[12]顯示，子癇前期患者胎盤絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力降低，會使子宮內(nèi)膜浸潤不足，阻礙子宮螺旋動脈重鑄，損傷全身血管內(nèi)皮，全身及胎盤小動脈痙攣，微小血管助力增加，進(jìn)而出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、水腫等表現(xiàn)。本研究顯示，HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在兩組胎盤組織中均有表達(dá)，但兩組HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)存在顯著差異，提示HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白可以與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

作為非經(jīng)典HLA I類分子的HLA-G主要分布于母胎界面絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層，可抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤和維持母體間免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用[13]。有研究[14-16]顯示，采用免疫組化SP法測定HLA-G在子病前期患者胎盤組織的表達(dá)水平低于正常妊娠孕婦，可能是由于HLA-G低表達(dá)的滋養(yǎng)細(xì)胞，更易遭受母體免疫系統(tǒng)的攻擊，不能有效侵入母體螺旋動脈，使胎兒動脈重鑄過程受阻，不利于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞著床及血管發(fā)育，胎盤營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足而引發(fā)病理妊娠。本研究顯示，孕婦胎盤組織中HLA-G蛋白表達(dá)水平與Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)，Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示HLA-G蛋白表達(dá)水平與Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)。目前，尚缺乏研究證實HLA-G低表達(dá)或表達(dá)缺陷是否會影響或引起Wnt5a和β-catenin蛋白信號表達(dá)通路的變化。本研究僅在組織水平上證實HLA-G蛋白表達(dá)水平與Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，尚未行細(xì)胞學(xué)實驗驗證HLA-G、Wnt5a和β-catenin蛋白三者之間的相關(guān)分子機制或生物學(xué)行為變化。因此，今后可進(jìn)一步通過動物或體外細(xì)胞實驗探究HLA-G、Wnt5a和β-catenin蛋白三者之間的相互調(diào)控關(guān)系及對重癥子癇前期母胎界面局部免疫系統(tǒng)和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以闡明子癇前期尤其是重癥子癇前期的發(fā)病機制。

子癇前期的重要特征是胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足和過度凋亡，其重要病理影響因素是氧化應(yīng)激激活，但具體的調(diào)節(jié)機制還未闡明。一項細(xì)胞實驗研究[17]表明，Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞極性、增殖、凋亡等生命活動中起著重要的調(diào)控作用，通路激活可以減輕胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧所致的損傷。李夏芳[18]研究報道，子癇前期胎盤組織中β-catenin蛋白含量明顯低于健康孕產(chǎn)婦，表明β-catenin蛋白低表達(dá)使Wnt/β-catenin信號通路受到抑制，進(jìn)而影響了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、凋亡及氧化應(yīng)激，這一系列的變化可能與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。β-catenin蛋白是介導(dǎo)經(jīng)典Wnt信號通路的一種多功能蛋白，兼具沉默和啟動靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和黏附連接，參與細(xì)胞骨架形成，在胚胎發(fā)育和著床、胎盤形成、血栓形成等妊娠各生理過程中起著調(diào)節(jié)作用[19]。據(jù)報道[20]，β-catenin蛋白水平降低會減弱人胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/Svneo的侵襲能力，抑制Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)子癇前期的發(fā)展。本研究中的重度子癇前期患者胎盤組織中β-catenin蛋白表達(dá)水平低于正常妊娠孕婦，也進(jìn)一步證明了β-catenin蛋白低表達(dá)與重度子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。

Wnt5a蛋白是Wnt家族的成員之一，也是介導(dǎo)非經(jīng)典Wnt信號通路的一種重要蛋白，在胚胎的分化和發(fā)育以及調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤過程中具有重要作用。一項體外細(xì)胞研究表明，人體子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中，孕酮促進(jìn)Wnt5a蛋白表達(dá)，與Wnt5a 蛋白受體結(jié)合，激活下游依賴cAMP的信號通路，促進(jìn)錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)釋放，進(jìn)而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。有研究[21]表明，子癇前期患者胎盤蛻膜組織中Wnt5a蛋白呈低水平表達(dá)，可能是由于滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足。Ujita等[22]研究表明，Wnt5a信號通路受損與胎盤形成不良和子癇前期密切相關(guān)。本研究中，重度子癇前期患者胎盤組織中Wnt5a 蛋白表達(dá)水平低于正常妊娠孕婦，表明Wnt5a蛋白低表達(dá)與重度子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。

本研究還顯示，孕婦入院平均動脈壓和尿蛋白水平與胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，重癥子癇組孕婦HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白水平降低，入院平均動脈壓和尿蛋白水平較高。其機制可能是重癥子癇孕婦HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白水平降低減弱了母胎免疫耐受程度和滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力，使胎盤著床淺，發(fā)生缺血缺氧，進(jìn)而釋放多種胎盤因子，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致孕婦血管平均動脈壓升高，滲透壓增大，尿蛋白含量增加。

綜上所述，重度子癇前期孕婦胎盤組織中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的表達(dá)水平降低，低于正常妊娠孕婦，提示HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白可能參與重度子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。今后可進(jìn)一步探究和闡明HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在重度子癇前期進(jìn)展中的具體發(fā)病機制，為臨床靶向藥物的研制提供參考依據(jù)。