腰椎關節突關節炎模型大鼠背根神經節中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達及意義

徐大偉， 崔勝宇， 薛鵬飛， 朱新輝， 劉巍， 崔志明

(南通大學第二附屬醫院骨科， 江蘇 南通 226001)

腰椎關節突關節引起的疼痛是成年人下腰痛的常見原因，約占所有下腰痛的15%～45%[1]。腰椎關節突關節引起的下腰痛原因是早期因腰椎關節突關節重復性應力和(或)累積的輕度外傷，逐漸演變成關節軟骨退變和關節炎癥，最終導致腰腿痛[2-3]。臨床研究表明，腰椎關節突關節軟骨和滑膜含有炎性細胞因子，并且細胞因子水平與腿部癥狀的程度相關[2，4]。實驗研究表明，腰椎關節突關節的炎癥會增加背根神經節(dorsal root ganglia，DRG)中炎癥細胞因子的表達，當炎癥細胞因子與神經根接觸時，神經組織發生病理性變化，表現出行為缺陷[3]。β-1,4-半乳糖基轉移酶-I(β-1,4-GalT-I)是關鍵的炎癥介質，參與疾病中炎癥反應的發生和維持。當機體缺失β-1,4-GalT-I時，白細胞膜上的糖蛋白缺少β4-N-乙酰乳糖胺結構，導致急、慢性炎癥反應降低，浸潤到炎癥部位的中性粒細胞減少[5]。有研究報道β-1,4-GalT-I參與了中樞和周圍神經損傷后的炎癥過程[6]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是周圍炎癥反應的重要介質，并且在各種神經疾病中也有合成和釋放，與神經源性疼痛有關[7]。本研究旨在探討β-1,4-GalT-I和TNF-α在腰椎關節突關節炎(lumbar facet arthritis，LFA)模型大鼠DRG中的表達變化及意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料

雄性SD大鼠54只(南通大學實驗動物中心)，體重(220～275)g。弗氏完全佐劑、小鼠抗GAPDH和神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體(美國Sigma公司)，纖維蛋白膠(上海萊士公司)，Von Frey纖維絲刺激針(美國Stoelting公司)，PVDF膜(美國Millipore公司)，山羊抗β-1,4-GalT-I單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗TNF-α單克隆抗體(英國Abcam公司)，兔抗p-ERK、p-JNK和p-P38單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，小鼠抗神經元(NeuN)單克隆抗體(美國Chemicon公司)。

1.2 動物模型

54只雄性SD大鼠隨機分為對照組和實驗組。按造模后取材時間將實驗組分為12 h，1 d，3 d，5 d，7 d，14 d和28 d等7個小組(每小組6只)。制備大鼠LFA模型(n=42)：向大鼠腹腔內注射復合麻醉劑(0.2 mL/100 g)，將大鼠俯臥位固定于實驗臺上。嚴格無菌操作下，首先在脊柱棘突正中線做一切口，沿左側的棘上韌帶切開筋膜約20 mm，再在顯微鏡下，切除附著于L5棘突的多裂肌，顯露左側L5-L6的關節突關節囊，在關節囊上做一個約3 mm的切口，向關節囊內注入1.2 μL弗氏完全佐劑，關節囊上的切口立刻用纖維蛋白膠密封，以防止佐劑泄漏，然后關上筋膜和皮膚切口。對照組(n=12)：左側L5-L6的關節突關節囊切開后，立即用纖維蛋白膠密封，不做其他的操作即關閉切口。大鼠室溫飼養，自由飲食。于術后各相應時間點，再次麻醉大鼠，取手術側節段對應DRG[3]。

1.3 機械性縮足閾值測定

通過確定大鼠足底對Von Frey纖維絲刺激針的縮回反應，測試大鼠對非有害機械刺激的敏感性。先將大鼠放置具有金屬絲網底部的塑料籠中適應約15 min。將細絲以足夠的壓力施加到左側L5神經支配的左足外側足底上，使其彎曲并保持6 s。如果大鼠在使用給定的細絲后沒有縮足，則以相同的方式測試下一檔較高的細絲。當大鼠確定縮足時，則測試上一檔較低的細絲，間隔幾秒鐘刺激1次。

1.4 蛋白質印跡測定β-1,4-GalT-I、TNF-α和MAPK信號通路相關蛋白水平

取實驗組LFA大鼠(12 h，1 d，3 d，5 d，7 d，14 d和28 d)和對照組大鼠DRG組織，提取蛋白質。蛋白樣品各50 μg上樣，進行SDS-PAGE，分離的蛋白用PVDF膜以350 mA轉膜2.5 h，所得PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后加入一抗：β-1,4-GalT-I、TNF-α、p-ERK、p-JNK、p-P38和GAPDH抗體(稀釋比均為1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，ECL發光、顯影、定影。

1.5 免疫熒光雙標檢測β-1,4-GalT-I/TNF-α與NeuN/GFAP的共定位

于手術后第5天，用復合麻醉劑腹腔麻醉大鼠后開胸，經左心室向升主動脈插管后，先灌入洗滌液(生理鹽水)200～300 mL，再灌進固定液(4%多聚甲醛)300～500 mL。取左側L5DRG浸于固定液中，20%、30%蔗糖依次梯度脫水。包埋橫切，冰凍切片機連續切片，厚度6 μm。以封閉血清37℃孵育切片2 h，分別用封閉液稀釋的一抗：β-1,4-GalT-I、TNF-α抗體(1 ∶100)，NeuN抗體(1 ∶600)和GFAP抗體(1 ∶200)，4℃孵育過夜，PBS洗滌后，加入FITC和TRITC偶聯的二抗，4 ℃孵育2 h，封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 機械性縮足閾值測定結果

機械性縮足閾值測定結果表明，各時間點機械性縮足閾值總體差異有統計學意義(F=5.138，P<0.05)。與對照組相比，實驗組LFA大鼠在第3、5和7天的機械閾值明顯降低(均P<0.05，圖1)，第5天降低最為明顯。

n=6；*：P<0.05，與對照組相比圖1 機械性縮足閾值測定結果

2.2 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達

蛋白質印跡結果表明，各時間點β-1,4-GalT-I和TNF-α蛋白水平總體差異均有統計學意義(F值分別為143.802、166.235，均P<0.05)。實驗組第3、5和7天β-1,4-GalT-I和TNF-α蛋白水平均較對照組明顯升高(均P<0.05)，并在第5天達到峰值，然后逐漸恢復到正常水平(圖2)。數據結果顯示，β-1,4-GalT-I和TNF-α蛋白水平在實驗組LFA大鼠DRG中有一個暫時的上調，表明它們可能參與了LFA大鼠DRG的炎癥反應過程。

n=3； *：P<0.05，與對照組相比圖2 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達

2.3 β-1,4-GalT-I和TNF-α在LFA大鼠DRG中分布情況

根據蛋白質印跡結果，選取實驗組第5天和對照組的大鼠DRG切片，運用免疫熒光共定位進一步分析β-1,4-GalT-I和TNF-α在DRG中的表達和分布情況。β-1,4-GalT-I和TNF-α在神經元細胞和神經膠質細胞中均有表達，而且β-1,4-GalT-I在LFA大鼠DRG神經元細胞(35.60±5.69)%和神經膠質細胞(43.60±5.81)%中表達較對照組神經元細胞(8.69±1.49)%和神經膠質細胞(10.36±1.95)%明顯增加(圖3，t值分別為7.924、9.394，均P<0.05)；TNF-α與β-1,4-GalT-I的結果相似，在LFA大鼠DRG神經元細胞(45.63±7.36)%和神經膠質細胞(42.96±5.96)%中表達較對照組神經元細胞(14.96±2.39)%和神經膠質細胞(18.36±3.59)%明顯增加(圖4，t值分別為6.865、6.124，均P<0.05)。

n=3； *：P<0.05，與對照組相比圖3 β-1,4-GalT-I在LFA大鼠DRG中的分布(×400)

n=3； *：P<0.05，與對照組相比圖4 TNF-α在LFA大鼠DRG中的分布(×400)

2.4 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I與TNF-α的共定位情況

在手術后第5天，當DRG中β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達接近峰值時，對β-1,4-GalT-I和TNF-α進行了免疫熒光雙標染色。結果顯示在LFA大鼠DRG中，β-1,4-GalT-I與TNF-α存在共定位(圖5)。

圖5 LFA大鼠DRG中β-1,4-GalT-I與TNF-α的共定位(×400)

2.5 LFA大鼠DRG中的MAPK信號通路活化情況

蛋白質印跡結果表明，與對照組相比，LFA大鼠手術后第5天時DRG中的MAPK信號通路(ERK、JNK和P38)被顯著激活(圖6)。

圖6 LFA大鼠DRG中的MAPK信號通路活化

3 討論

在臨床研究中，許多腰椎管狹窄癥的中老年患者都有影像學證據顯示神經根受壓，但沒有神經根的疼痛癥狀。而且，許多接受保守治療的患者癥狀會明顯改善，但影像學神經受壓并無變化[8]。這些現象表明，機械壓迫不是引起神經根病的唯一因素。反復的應力或積累性微小創傷可以導致腰椎關節突關節炎癥，引起關節積液和腫脹、滑膜增生、軟骨退變，并且產生和釋放TNF-α等炎癥因子，炎癥因子可以直接刺激關節囊感覺纖維或通過椎間孔刺激脊髓神經和滲透到DRG而導致下腰痛[2-4]。本研究中機械性縮足閾值測定結果提示腰椎關節突關節的炎癥可能會導致下肢疼痛。

本研究結果表明，LFA大鼠DRG中神經元和神經膠質細胞β-1,4-GalT-I和TNF-α的表達增加。TNF-α在促進神經性疼痛的發展中起著不可或缺的作用，許多使用細胞因子抑制劑、基因敲除小鼠或直接應用細胞因子觀察電生理活動和行為后遺癥的研究均支持TNF-α參與神經性疼痛的發展[9-10]。Miyagi等[11]發現大鼠腰椎關節突關節損傷后DRG衛星細胞中產生的TNF-α被軸突轉運至DRG神經元和脊髓背角。Tachihara等[3]發現TNF-α在關節突關節的滑膜細胞中產生，然后可能擴散并滲入硬膜外間隙，當TNF-α與神經根接觸時，會引起神經損傷。此外，本研究還發現，在LFA大鼠DRG中的β-1,4-GalT-I與TNF-α存在共定位。有報道，在周圍神經施萬細胞中，TNF-α可以誘導β-1,4-GalT-I的產生[6]，且沉默β-1,4-GalT-I可以抑制TNF-α自分泌，而β-1,4-GalT-I的過表達可以促進TNF-α的自分泌[12]。在DRG炎癥過程中，β-1,4-GalT-I可能在TNF-α的表達中起重要作用，從而加劇神經根痛。β-1,4-GalT-I和TNF-α可能相互促進，形成正反饋作用，并增強TNF-α在神經痛中的作用。

本研究結果還顯示，LFA大鼠DRG中MAPK信號通路被激活。MAPK信號通路在調節炎癥(包括分泌TNF-α)中至關重要。先前的研究表明，在施萬細胞中，β-1,4-GalT-I可以通過激活MAPK信號通路和TNF受體1促進TNF-α分泌[12]。脂多糖刺激施萬細胞后通過MAPK信號通路可以調節β-1,4-GalT-I的表達[13]。MAPK信號通路參與TNF-α誘導的各種炎癥介質的表達，包括各種細胞因子、趨化因子和黏附分子。研究表明，TNF-α可以激活MAPK[12]和核因子κB(NF-κB)[14]信號通路，從而誘導Snail家庭轉錄因子-2(SNAI2)、葡萄糖轉運蛋白1、細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1等基因和蛋白的表達；當TNF-α與TNF受體1結合時，募集一些信號蛋白到受體的胞質域，例如TNF受體1相關死亡域蛋白(TRADD)、受體相互作用蛋白1(RIP1)、Fas相關死亡域蛋白(FADD)和TNF受體相關因子2(TRAF2)[15]。這些信號蛋白的激活導致下游MAPK信號通路如JNK和P38的激活。

總之，大鼠LFA可以導致DRG中神經元細胞和神經膠質細胞β-1,4-GalT-I和TNF-α表達增加，可能與LFA引起的下肢神經癥狀密切相關。研究結果為LFA引起下腰痛的發病機制提供了理論依據。