血漿游離雙鏈DNA在原發性肝癌中的診斷價值

安仙園 ,袁丹丹 ,徐憶秋 ,沈國榮

(1. 華東療養院檢驗科，江蘇 無錫 214065； 2. 南京醫科大學附屬無錫第二醫院檢驗科，江蘇 無錫 214002； 3. 蘇州大學附屬蘇州九院檢驗科，江蘇 蘇州 215200)

原發性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)分為肝細胞癌、膽管癌以及混合癌。甲胎蛋白(AFP)是肝細胞癌的生物標志物，39%～65%的肝細胞癌患者血漿AFP升高[1]。糖類抗原12-5(CA12-5)、糖類抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)作為胃腸道惡性腫瘤診斷的指標，可為膽管癌的診斷提供部分依據[2-4]。雖然如此，PHC診斷到目前為止仍然沒有特異性的標志物。為了解決PHC的診斷問題，腫瘤標志物包括AFP、CA19-9、CA12-5和CEA聯合用于PHC的診斷已有報道[5-6]。此外，新的生物標志物，例如高爾基體蛋白73(GP73)[7]，glypican-3(GPC-3)[8]和microRNA[9-10]也正在研究中。然而，診斷敏感度和(或)特異度不足限制了這些標志物在臨床中的應用。

早期研究表明，定量檢測血漿游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)對PHC診斷具有價值[11]。由于cfDNA的定量分析不能提供PHC潛在的分子靶標信息，因此近10多年幾乎放棄了對cfDNA定量檢測的研究。盡管cfDNA定量分析在肝癌中的應用備受爭議，但它具有簡單、快速和價格低廉等優點。隨著技術的發展， cfDNA的定量檢測仍然具有很大的應用價值[12]。

雙鏈DNA (double-stranded DNA，dsDNA)是cfDNA的重要組成部分，復制壓力引起的DNA斷裂是dsDNA異常產生的重要原因[13]。肝臟作為最大的代謝器官承受巨大的復制壓力，因此我們推測血漿dsDNA可能是PHC的標志物。本研究探討血漿中游離雙鏈DNA(cell-free double-stranded DNA，cf-dsDNA)在PHC診斷中的應用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

招募2019年5月至10月南京醫科大學附屬無錫第二醫院收治的62例PHC患者、41例良性肝病患者以及45例健康對照。PHC和良性肝病的診斷主要基于臨床癥狀、影像學和傳統腫瘤標志物檢查。按照AFP參考范圍(<9 ng/mL)，62例PHC患者中34例為AFP陰性，28例為AFP陽性。PHC的分期根據腫瘤淋巴結轉移(tumor node metastasis，TNM)分類進行。

良性肝病包括膽囊炎7例，膽結石5例，肝囊腫2例，肝血管瘤11例，病毒性肝炎12例和肝硬化4例。健康對照的納入標準：腫瘤標志物、肝炎標志物和體檢沒有異常。健康個體的排除標準：曾經接受二線治療，患有良性腫瘤、慢性炎性疾病和自身免疫性疾病。收集術前/治療前患者和健康對照的清晨空腹外周血。

本研究通過了南京醫科大學附屬無錫第二醫院倫理委員會的審核，項目編號：(2019)倫理審查第(Y-25)號。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

磁珠法cf-dsDNA提取試劑盒和磁力架(江蘇昱安生物科技有限公司)，Qubit 1×dsDNA HS分析試劑盒和Qubit 3.0熒光計(美國Life Technologies公司)。AFP、CA19-9、CA12-5和CEA電發光定量檢測試劑盒和Cobas e602全自動電化學發光分析儀(德國羅氏公司)。

1.3 cf-dsDNA的定量檢測

1.3.1 血漿制備 1 900×g離心EDTA抗凝血10 min，收集血漿。再以16 000×g離心10 min。收集血漿，-80℃保存備用。

1.3.2 cf-dsDNA提取 500 μL血漿中加入1 mL裂解吸附液和10 μL蛋白酶K，1 500 r/min 60 ℃振蕩10 min。加入10 μL磁珠，1 500 r/min室溫振蕩10 min。分離磁珠，洗滌后用25 μL洗脫液洗脫收集cf-dsDNA，-20℃保存備用。

1.3.3 cf-dsDNA定量 在195 μL Qubit 1×dsDNA HS分析試劑中加入cf-dsDNA提取物5 μL，混勻后避光室溫放置2 min。用Qubit 3.0熒光計以1 μL讀數模式檢測cf-dsDNA濃度。

1.4 血清AFP、CA19-9、CA12-5和CEA水平測定

2 000×g離心全血30 min，收集血清， -20℃保存備用。用Cobas e602分析儀測定AFP、CA19-9、CA12-5和CEA水平，正常參考上限分別為9 ng/mL、35 U/mL、35 U/mL和5 ng/mL。

1.5 統計學分析

應用SPSS 16.0進行統計分析，數據以中位數(四分位間距)表示。定量參數采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-WallisH檢驗分析，多組率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析。標志物的診斷效率采用受試者工作特征(ROC)曲線分析，選擇約登指數最大的點作為臨界值，ROC曲線下面積(AUC)采用雙側95%置信區間報告。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 傳統腫瘤標志物和cf-dsDNA在三組研究對象中的差異分析

如表1所示，PHC、良性肝病和健康對照之間，血清AFP、CA19-9、CA12-5、CEA水平均存在顯著差異(P均<0.01)，PHC患者血漿cf-dsDNA水平顯著高于良性肝病和健康對照者(H=93.54，P<0.01)。

表1 受試者腫瘤標志物水平

2.2 血漿cf-dsDNA水平與PHC患者臨床特征的關系

在PHC患者中，cf-dsDNA水平在年齡、性別、AFP水平、PHC類型以及腫瘤大小之間均無明顯差異(P均>0.05)，見表2。cf-dsDNA水平與PHC的TNM分期之間存在等級相關性，等級相關系數(rs)為0.311(P=0.013 9)。

表2 cf-dsDNA水平與PHC患者臨床特征的關系

2.3 cf-dsDNA在PHC中的診斷作用

單獨用于PHC診斷，AFP的AUC為0.742，CA12-5的AUC為0.781，AFP、CA19-9，CA12-5和CEA聯合診斷的AUC為0.866。cf-dsDNA 診斷PHC的AUC為0.965。cf-dsDNA聯合AFP診斷的AUC為0.976，cf-dsDNA聯合所有腫瘤標志物診斷PHC的AUC為0.979。見表3和圖1。

表3 各種標志物對PHC的診斷效率

A:傳統腫瘤標志物和cf-dsDNA；B:cf-dsDNA聯合不同腫瘤標志物圖1 各種標志物診斷PHC的ROC曲線

2.4 各標志物在PHC中的陽性率

根據表3中各標志物的臨界值，cf-dsDNA在PHC中的陽性率為90.32%(56/62)，AFP的陽性率為45.16%(28/62)，CA19-9的陽性率為48.39%(30/62)，CA12-5的陽性率為70.97%(44/62)，CEA的陽性率為64.52%(40/62)，cf-dsDNA在PHC中的陽性率明顯高于傳統腫瘤標志物(χ2=36.00，P<0.01)。而cf-dsDNA在良性肝病和健康對照中cf-dsDNA的陽性率分別為9.76%(4/41)和2.22%(1/45)。cf-dsDNA在肝細胞癌、膽管癌和混合型PHC中的陽性率無明顯差異(P=0.612 2)，CA19-9和AFP在三者之間的陽性率也無明顯差異，而CA12-5和 CEA陽性率在三者之間有顯著差異。見表4。cf-dsDNA聯合所有傳統腫瘤標志物在PHC中的陽性率為87.10%(54/62)。

表4 各種標志物在不同類型PHC中的陽性率 例(%)

3 討論

PHC的血液學診斷是亟待解決的難點，腫瘤標志物聯合診斷是解決方案之一[5-6]。我們的數據顯示，單獨用于PHC診斷，傳統腫瘤標志物中CA12-5的診斷效率最高，其AUC為0.781。應該注意的是，雖然CA12-5用于PHC診斷的理論效率較高，但是CA12-5的臨界值低于正常參考上限(35 U/mL)，這明顯與臨床應用不符。盡管AFP、CA19-9、CA12-5和CEA聯合診斷PHC的AUC理論上達到了0.866，但用于診斷的臨界值計算較為復雜。除此之外，AFP、CA19-9、CA12-5和CEA還受到例如吸煙、飲酒、血糖水平、年齡、性別、月經、懷孕等因素的影響[14-15]。因此，傳統腫瘤標志物單獨或聯合不能滿足臨床對PHC診斷的需求。

血漿dsDNA水平可能是PHC的良好標志物[11-12]。本研究中，PHC患者cf-dsDNA水平顯著高于良性肝病患者和健康對照。cf-dsDNA作為PHC診斷標志物的AUC為0.965。根據文獻報道的標準[16]，我們認為cf-dsDNA水平對PHC具有良好的診斷效率。有研究表明，cfDNA與AFP結合可以提高PHC的診斷效率[17]。但本研究中，cf-ds-DNA與AFP聯合或者與所有傳統腫瘤標志物聯合僅略微提高PHC的診斷效率(AUC分別為0.976和0.979)。與單獨的cf-dsDNA相比，cf-dsDNA無論是與CA19-9、CA12-5還是CEA聯合都不能明顯提高PHC的診斷效率，并且這些聯合指標的AUC、敏感度和特異度與cf-dsDNA單獨診斷幾乎相同。這一結果說明，在聯合指標中cf-dsDNA起著至關重要的診斷作用。

值得關注的是，cf-dsDNA水平在AFP陰性和陽性PHC之間以及在PHC類型之間均無明顯差異。根據臨界值判斷，cf-dsDNA在不同類型PHC中的陽性率也無明顯差異，但明顯高于傳統腫瘤標志物。在所有受試者中，PHC患者cf-dsDNA的陽性率明顯高于良性肝病和健康對照。且使用聯合指標不能提高PHC的陽性率(87.10%)。上述結果表明，cf-dsDNA在各種類型PHC中均具有良好的鑒別診斷能力，可以彌補傳統腫瘤標志物的不足。

除了診斷價值之外，本研究結果顯示，cf-dsDNA水平與腫瘤大小無關，但與TNM分期有關。這說明cf-dsDNA水平有望用于腫瘤轉移的判斷，這個推論還需要更多樣本的驗證。

盡管本研究結論明確，但仍存在一些局限性。首先，基于ROC分析的臨界值需要獨立驗證。其次，PHC病例數量不多，因此應謹慎看待相關推論，尤其是與P值略低于0.05的相關性推論。第三，由于沒有進行隨訪，cf-dsDNA在PHC進展、預后和療效評估中的應用尚需進一步探討。綜上所述，本研究結果顯示cf-dsDNA可作為PHC診斷的良好標志物，隨著研究的深入，該結論有望應用于臨床。