3種主要短鏈脂肪酸減輕5-氟尿嘧啶誘發的THP-1細胞炎癥反應

席月， 陳述， 丁龍坤， 夏雯， 戴曉玥， 閆曼，張敏， 吳亮， 馬潔， 陰晴， 許化溪

(1. 江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇大學附屬醫院檢驗科， 江蘇 鎮江 212001)

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids， SCFAs)是腸道內厭氧菌發酵膳食纖維的主要代謝產物，主要有乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉，占總量90%以上，通常以離子狀態存在[1-2]。SCFAs可促進腸黏膜上皮細胞增殖，減輕腸黏膜萎縮，維護腸黏膜的正常形態。臨床研究結果表明，通過增加膳食纖維或SCFAs攝入量，可以改善結直腸炎患者治療效果，但其確切機制仍不明晰[3]。

5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是目前常用的一類抗癌藥物，通過干擾DNA合成阻斷腫瘤細胞分裂增殖，廣泛用于乳腺癌、胃腸道腫瘤和頭頸部腫瘤等治療[4-5]。但是，在治療過程中有40%～80%患者會出現嚴重腸黏膜炎等不良反應，甚至造成化療無法繼續[6]。5-FU可以誘發健康小鼠腸道強烈炎癥反應，并致其腸黏膜中巨噬細胞NOD樣受體家族3(NLRP3)炎癥小體活性顯著升高，而以5-FU刺激NLRP3基因缺陷小鼠則僅出現輕微的腸黏膜炎癥反應[7]。因此，通過下調細胞NLRP3炎癥小體的活化，抑制腸黏膜中炎癥反應可以減輕5-FU誘發的腸黏膜炎，改善小鼠對5-FU的耐受程度。目前，關于SCFAs對5-FU所誘發的巨噬細胞炎癥反應的影響尚不清楚。因此，本研究探討乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對5-FU所誘發巨噬細胞炎癥反應的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

人單核巨噬THP-1細胞購自上海細胞庫，由本實驗室自行保種和培養；5-FU注射液(天津金耀氨基酸有限公司)；乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉均為國產分析純；RPMI 1640細胞培養液和胎牛血清(以色列BI公司)；熒光定量PCR儀、免疫印跡系統及凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；2×TaqPCR預混液、逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(SYBR Green染料法)、總RNA提取試劑盒均為南京諾唯贊公司產品；引物由蘇州金唯智生物科技公司合成；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、細胞核蛋白和細胞質蛋白抽提試劑盒、活性氧檢測試劑盒為碧云天生物技術公司產品；ELISA試劑盒以及兔抗TLR9、NLRP3、Caspase-1、Beclin-1、LC3-Ⅱ、組蛋白H1、NF-κB p65、鼠抗β-肌動蛋白抗體和HRP標記的山羊抗兔或鼠抗體(美國ABclonal生物科技公司)；ECL顯色液(美國Thermo公司)。

1.2 細胞培養

THP-1細胞按常規方法培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5% CO2穩定傳代至第6代后用于本研究。取對數生長期細胞接種于6孔板(1×106個/孔)，37 ℃、5% CO2培養過夜。

1.3 細胞分組及處理

將THP-1細胞分為5組，分別為對照組、5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組、5-FU+丁酸鈉組和5-FU組。5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細胞預先分別以100 μmol/L乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉處理24 h，再與5-FU組一并加入2.5 mmol/L 5-FU刺激細胞24 h，誘發炎癥反應；對照組細胞未經任何處理。收集細胞用于后續研究。

1.4 qRT-PCR檢測THP-1細胞炎性相關因子mRNA表達

用Trizol試劑抽提THP-1細胞總RNA，以oligo(dT)為引物經逆轉錄合成cDNA鏈，行qRT-PCR。qRT-PCR反應總體系共20 μL，包括SYBR Green Master預混液10 μL，上、下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，cDNA模板2 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性3 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，反應共計40個循環。以GAPDH作為內參，通過公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 ELISA法測定細胞因子水平

收集各組細胞培養上清液各2 mL，4 ℃、1 000 r/min離心20 min；取上清液，按ELISA試劑盒檢測上清液中IL-1β、IL-6和IL-10含量。用酶標儀檢測450 nm處光密度值，繪制相應細胞因子檢測的標準曲線，并計算各組細胞上清液中細胞因子含量。

1.6 蛋白質印跡法檢測通路相關蛋白和自噬蛋白表達

1.6.1 TLR9、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達檢測 每孔細胞中加入120 μL RIPA裂解液(含1.2 μL PMSF)于冰上裂解30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；收集上清液。100 V恒壓電泳120 min；300 mA恒流90 min轉印至PVDF膜；用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h；加入兔抗TLR9、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ、Beclin-1和鼠抗β-肌動蛋白抗體，1 ∶1 000稀釋，于4 ℃孵育過夜；次日以TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min；加入羊抗兔(鼠)IgG-HRP (1 ∶2 000)室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；采用ECL顯色液曝光顯色，通過灰度掃描分析分析各目的蛋白表達量。

1.6.2 胞質和胞核NF-κB p65蛋白表達檢測 按照試劑盒使用說明書操作，每孔加入150 μL細胞質蛋白抽提試劑A(含1.5 μL PMSF)劇烈振蕩5 s后冰浴15 min；加入細胞質蛋白抽提試劑B 10 μL劇烈振蕩5 s后冰浴1 min；4 ℃、12 000 r/min離心5 min；收集上清液即獲得細胞質蛋白；吸盡殘余上清液，在沉淀中加入50 μL細胞核蛋白抽提試劑(含0.5 μL PMSF)，冰上裂解30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液即獲得細胞核蛋白。蛋白質印跡檢測同“1.6.1”。

1.7 流式細胞術檢測活性氧水平

采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針法檢測THP-1細胞中活性氧水平。無血清培養基按照1 ∶1 000稀釋DCFH-DA至終濃度為10 μmol/L。細胞重懸于稀釋后的DCFH-DA探針溶液中，于37 ℃細胞培養箱內避光孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻，使探針和細胞充分接觸。無血清細胞培養基洗滌3次，以去除未進入細胞內的DCFH-DA探針，再以無菌PBS重懸細胞后進行檢測。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 3種SCFAs對5-FU誘導THP-1細胞炎癥相關因子表達的影響

與對照組比較，5-FU組IL-1β和IL-6表達量均顯著升高(P<0.01)；與5-FU組比較，5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組IL-1β表達量均顯著降低(P<0.01)；5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組IL-6表達量均顯著降低(P<0.01)，其中5-FU+乙酸鈉組IL-6表達量下降較其他兩組更顯著(P<0.01)；5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組IL-10及其mRNA表達量均顯著升高(P<0.01)。見圖1。

①：對照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較；c：P<0.05，與5-FU+乙酸鈉組比較圖1 qRT-PCR和ELISA法檢測細胞因子mRNA表達及含量

2.2 3種SCFAs對THP-1細胞TLR9、NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表達的影響

與對照組比較，5-FU組TLR9、NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.01)。與5-FU組比較，5-FU+乙酸鈉組和5-FU+丙酸鈉組細胞TLR9 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.01)；5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細胞NLRP3和Caspase-1mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.01)。見圖2。

①：對照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較圖2 qRT-PCR和蛋白質印跡法分別檢測TLR9、NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表達

2.3 3種SCFAs對THP-1細胞自噬相關蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，5-FU組細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；與5-FU組比較，5-FU+乙酸鈉組相比、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；與5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組比較，5-FU+乙酸鈉組細胞Beclin-1表達量明顯降低(P<0.05)；與5-FU+乙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組比較，5-FU+丙酸鈉組組細胞LC3-Ⅱ表達量明顯降低(P<0.05)。

①：對照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較；c：P<0.05，與5-FU+乙酸鈉組比較；d：P<0.05，與5-FU+丙酸鈉組比較圖3 蛋白質印跡法檢測THP-1細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達

2.4 3種SCFAs對THP-1細胞NF-κB信號通路活化能力的影響

蛋白質印跡法檢測結果顯示(圖4)，與對照組比較，5-FU組胞核內NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，胞質中NF-κB p65蛋白表達水平則明顯降低(P<0.01)。與5-FU組比較，5-FU+乙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細胞核內NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；5-FU+丁酸鈉組細胞胞質中NF-κB p65蛋白表達水平則明顯升高(P<0.01)。與5-FU+乙酸鈉組比較，5-FU+丁酸鈉細胞核內NF-κB p65蛋白表達明顯降低(P<0.01)。

①：對照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較；c：P<0.01，與5-FU+乙酸鈉組比較圖4 蛋白質印跡法檢測THP-1細胞胞質和胞核中NF-κB p65蛋白水平

2.5 3種SCFAs對THP-1細胞活性氧生成能力的影響

流式細胞術檢測結果顯示(圖5)，與對照組相比，其余4組活性氧生成水平均顯著升高(P<0.01)。

與5-FU組比較，5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組THP-1細胞活性氧水平顯著降低(P<0.01)。

①：對照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較圖5 流式細胞術檢測THP-1細胞活性氧水平

3 討論

5-FU在干擾腫瘤細胞DNA合成的同時也對正常組織細胞的DNA合成造成干擾，導致細胞死亡并釋放出大量雙鏈DNA(dsDNA)。在此過程中，細胞自身dsDNA作為一種重要的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)，是誘發炎癥反應和自身免疫損傷的關鍵因素[8]。死亡細胞釋放出的自身dsDNA可以經免疫細胞(如巨噬細胞和樹突狀細胞等)表面TLR9受體識別，并將信號傳遞至細胞內激活相關DNA感受器，進而誘發炎癥反應[9]。本研究發現5-FU可以上調THP-1細胞TLR9表達，并促進NF-κB p65蛋白入核，激活NLRP3炎癥小體，最終導致各種促炎因子表達水平和細胞內活性氧水平升高。由此提示，5-FU可能通過TLR9/NF-κB/ROS信號通路激活THP-1細胞NLRP3炎癥小體繼而引發強烈炎癥反應。

自噬是哺乳動物細胞的一種特殊死亡形式，對于維持機體的穩態有重要意義，在饑餓或其他應激如缺氧、活性氧、DNA損傷等刺激下被激活[10-11]。Beclin-1基因是第一個經確認的哺乳動物自噬調控基因，其編碼產物Beclin-1是自噬發生的標志蛋白[12]。LC3-Ⅱ是目前發現的唯一定位于自噬體膜上的自噬相關蛋白，其含量與自噬泡數量成正比[13]。巨噬細胞是宿主固有免疫的重要組成部分，其大量自噬發生雖然可以降低各種炎性細胞因子的釋放，但機體免疫防御能力也隨著巨噬細胞數量的減少而降低。確保降低巨噬細胞炎癥反應的同時仍維持一定水平的免疫力是目前腫瘤治療面臨的兩難局面[14-15]。本研究發現，3種SCFAs均可不同程度地抑制THP-1細胞炎癥反應，降低細胞炎癥反應水平，同時降低THP-1細胞自噬水平以維持細胞數量。經過3種SCFAs孵育后，THP-1細胞Th1型細胞因子(IL-1β)表達顯著降低，而Th2型細胞因子(IL-10)表達顯著升高，提示SCFAs在抑制巨噬細胞過度炎癥反應的同時，還有利于組織的修復，這對于腫瘤化療患者極為有利。

在人體腸道中，SCFAs濃度可達70～140 mmol/L，并迅速經血液吸收，其中主要包括乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉[16]。腸道中發酵產生的SCFAs不僅能為腸黏膜上皮細胞增殖提供能量，促進細胞代謝和生長，還可調節人體腸道菌群組成，減少有害菌的生長，防止腸道功能紊亂[17]。更重要的是，SCFAs能夠抑制免疫細胞釋放各種促炎因子，抑制腸道內過度的炎癥反應，減輕結直腸炎患者腸道黏膜損傷[18-19]。已有研究結果表明，3種重要SCFAs(乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉)均能減少免疫細胞促炎因子釋放，抑制炎癥反應，并且在較低濃度(1～1 200 mol/L)即可促進抗炎細胞因子IL-10大量生成；同時乙酸鹽和丁酸鹽還可以通過抑制NF-κB信號通路活化發揮抗炎作用[20]。本文研究結果與上述研究一致，丙酸鈉和丁酸鈉能顯著下調THP-1細胞促炎因子IL-1β表達，3種SCFAs均顯著降低細胞促炎因子IL-6表達，并顯著上調抗炎因子IL-10表達，丙酸鈉還可降低細胞活性氧生成，而乙酸鈉和丁酸鈉可以顯著抑制NF-κB p65蛋白移位至細胞核內，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活進而降低炎癥反應。

綜上所述，3種SCFAs均可降低5-FU誘導的THP-1細胞自噬水平；丙酸鹽和丁酸鹽可以通過抑制NLRP3炎癥小體激活下調IL-1β表達；乙酸鹽和丙酸鹽可以抑制細胞TLR9活化，而丁酸鹽對細胞TLR9表達無明顯影響，但可以顯著顯抑制NF-κB p65蛋白移位至細胞核內。3種SCFAs均可體外抑制巨噬細胞炎癥反應，但具體機制并不完全一致，可能是因為SCFAs可以作為能量物質影響細胞自噬，也可作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑影響NLRP3炎癥體，具體原因還有待進一步探討。