基于網絡藥理學和分子對接探討涼血消斑湯治療尋常型銀屑病的作用機制

湯菲菲， 梁鵬晨， 石涵芬， 張澤涵， 孟慶鴻，程發峰， 王慶國， 王雪茜

(1. 北京中醫藥大學中醫學院， 北京 100029； 2. 上海中醫藥大學研究生院， 上海 201203)

銀屑病是T細胞介導的慢性炎癥性皮膚病, 典型特征是表皮增生、角化過度、炎性細胞浸潤及新生血管形成[1-2]，其病理主要包括角質形成細胞增殖和分化異常，角質層Munro微膿瘍形成以及真皮淺層以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤[3]。銀屑病的全球患病率為0.1%～3.0%[4]，根據一項中國六省市調研結果顯示，我國銀屑病患病率達0.6%，且臨床分型以尋常型銀屑病為主(97.06%)[5]。銀屑病由多個基因控制，并且還受到諸如遺傳、感染、代謝和免疫功能障礙等因素的影響[6-7]。

涼血消斑湯是王慶國教授治療銀屑病血熱證的代表方，以白虎湯合清營湯為基礎加減而成，由生石膏、知母、水牛角絲、連翹、生地、赤芍和忍冬藤等藥味組成。全方以大劑量石膏為君，聯合涼血清氣之品，發揮“透熱轉氣”之功，“透熱轉氣”法也是臨床上治療銀屑病血熱證的思路之一。但復方存在復雜的物質基礎和多靶點、多途徑的效應模式，為系統研究涼血消斑湯對銀屑病的作用機制，本研究通過網絡藥理學方法來挖掘復方的作用靶點與通路，在此基礎上利用核心分子-蛋白對的分子對接來進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 藥物潛在靶標與疾病基因獲取

在TCMSP(http:∥www.tcmspw.com/tcmsp.php)平臺檢索知母、赤芍及連翹的化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18作為篩選標準得到這三味藥的有效成分，同時在此數據庫獲得所有有效成分的作用靶點。通過BATMAN-TCM(http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)得到生石膏、生地黃、水牛角和忍冬藤的有效成分及對應的作用靶點(分數閾值≥20)。

以“psoriasis”作為關鍵詞，從GeneCards數據庫中得到銀屑病相關基因。

1.2 交集基因與核心基因篩選

運用R語言將該方藥物成分的預測靶點與銀屑病相關靶點進行映射，得到涼血消斑湯與銀屑病的交集靶點。將得到的交集靶點上傳到STRING(https:∥string-db.org/)，根據交集基因之間的相互作用計算每個基因的結點評分，再將評分數據輸入到Cytoscape 3.7.2軟件中，利用Cytohubba插件和馬修斯相關系數(MCC)算法篩選出結點評分≥2倍中位數的基因，即核心基因。

1.3 PPI與藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

將篩選所得核心基因導入STRING數據庫，蛋白質類型定義為“Homo sapiens”，設定置信度得分≥0.4，去除游離蛋白，得到蛋白的相互作用關系后導入Cytoscape 3.7.2軟件，分別構建核心基因之間的蛋白互作網絡(PPI)以及藥物-成分-靶點-疾病網絡模型[8]。運用R語言基于蛋白間相互作用度值繪制排名前30的基因靶點條形圖。

1.4 通路富集分析

將篩選的核心交集靶點導入Metascape平臺(http:∥metascape.org)，該平臺提供的富集分析包括KEGG、GO、R-HAS(生物學反應及信號通路)、Canonical Pathways(經典通路)、hall標記基因集等，將所有具有統計學意義的富集項通過累積超幾何P值和富集因子進行篩選過濾，根據基因間的κ統計相似性將剩余的富集項分層聚類，以κ值=0.3作為閾值，將分層聚類樹轉化為富集項集群。以集群中具有代表性的富集項作為該群集的子集，并通過Cytoscape 3.7.2構建可視化子集網絡。

通過MCODE算法對PPI網絡進行蛋白質緊密度識別和模塊劃分。通過富集分析，羅列出每個模塊P值排名前3位的富集項。

1.5 分子對接

通過PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取化合物的MOL2文件，用Open Babel 2.3.2軟件將MOL2文件轉化為PDB文件，從Protein Data Bank (http:∥www.rcsb.org/pdb) 數據庫中檢索獲得相應的受體蛋白，利用PyMol 2.3.4和AutoDockTools軟件對受體蛋白進行系列操作與修飾，利用AutoDock Vina 1.1.2對5個受體蛋白與9個配體分子兩兩進行分子對接，所得結合能越低則提示受體與配體的結合效果越好。本研究假設結合能<-8 kcal/mol為結合具有顯著性，以此驗證涼血消斑湯在銀屑病治療中的合理性。利用Ligplus軟件分析化合物與蛋白對接的疏水和氫健作用力。

2 結果

2.1 藥物-疾病交集基因與核心基因篩選結果

根據篩選原則，從TCMSP和BATMAN數據庫中獲得涼血消斑湯的有效成分共121個，可預測到932個對應的非重復靶標。在GeneCards數據庫中檢索“psoriasis”，共發現3 766個與銀屑病相關的基因。通過韋恩圖的繪制發現，藥物潛在靶標與疾病基因之間共有270個交集基因。將這270個交集基因在STRING數據庫中的信息導入Cytoscape 3.7.2軟件，通過cytohubba插件計算每個基因的MCC得分，求得其中位數為120 444 286，根據“≥2倍中位數”的篩選原則，精選得到128個核心基因。

2.2 PPI與涼血消斑湯-化合物-靶點-銀屑病網絡構建結果

將128個核心基因導入STRING數據庫得到PPI網絡及根據節點的度值繪制的條形圖(圖1)，網絡圖由128個節點和3 370條邊構成，在PPI網絡的蛋白中，度值排名前10的分別為胰島素(INS)、蛋白激酶1(AKT1)、白介素6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、表皮生長因子受體(EGFR)、JUN蛋白(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)。

圖1 蛋白互作網絡圖與其條形圖

使用Cytoscape 3.7.2軟件構建涼血消斑湯-化合物-靶點-銀屑病網絡(圖2)。圖中共有190個節點，613條線。紅色和深藍色標識分別代表疾病和中藥復方，綠色和淺藍色分別代表疾病的基因靶標和復方的有效成分，連線反映有效成分效應的靶標。

圖2 涼血消斑湯-化合物-靶點-銀屑病網絡

2.3 Metascape平臺分析結果

利用Metascape平臺對128個交集靶點進行處理，得到本體集群富集結果，根據P值從小到大排列，取P值最小的前20項列舉如下(圖3)。涼血消斑湯在干預銀屑病的過程中主要涉及的生物學功能包括：對脂多糖的反應、對毒物的反應、凋亡信號通路、對無機物的反應、對傷口的反應、對肽的反應、對胞外刺激的反應、血管發育、細胞黏附調節、細胞死亡的積極調控、對生長因子的反應及活性氧代謝過程等，主要涉及的通路包括：白介素信號、癌癥通路、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、AP1通路和ATF2通路等，與銀屑病密切相關的生物學功能與通路主要有凋亡信號通路、血管發育、細胞黏附調節、細胞死亡的積極調控以及白介素、IL-17、PI3K-Akt等信號通路等。

圖3 本體集群富集條形圖

進一步得到子集網絡，每個圓形節點代表一個富集項，不同顏色代表不同的子集，圓形大小與每個子集所含基因數成正比，κ相似性>0.3的富集項之間由邊相連，且連線的粗細與κ值成正比。通過“力導向”的布局模式使每個子集更加聚集。子集標簽是從每個集群中選擇的一個富集項的名稱。用顏色的深淺來表達每個富集項的P值，顏色越深P值越小，見圖4。

不同顏色代表不同模塊，顏色的深淺代表不同P值圖4 本體集群富集網絡

將MCODE算法運用到PPI網絡中，識別蛋白緊密相關的鄰域，每個顏色代表1個MCODE網絡，同一模塊的蛋白聯系更為緊密，共得到6個MCODE網絡(圖5)，MCODE1和MCODE2與艾滋病、乙型肝炎、神經酰胺通路和癌癥通路相關，MCODE3與癌癥、內分泌相關，MCODE4與細胞凋亡有關，MCODE5與肽基酪氨酸磷酸化調控、癌癥中的蛋白聚糖有關，MCODE6與肽配體結合受體、G蛋白偶聯受體信號通路有關。每個模塊單獨羅列(圖6)。每個網絡進行富集分析，P值排名前3位的富集項被保留(表1)。

圖5 PPI網絡

圖6 PPI網絡模塊組成

表1 富集項列表

2.4 分子對接結果

根據蛋白互作結果度值排名前10的靶點，再篩選出靶點數、對應成分數最多的成分和靶點，由此得到涼血消斑湯治療銀屑病可能的關鍵成分與靶標：薯蕷皂苷元(Diosgenin)、己醛(Hexanal)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素(Quercetin)、漢黃芩素(Wogonin)、黃芩素(Baicalein)、油酸(Oleic acid)、水楊酸(Salicylic acid)等9個成分以及AKT1、IL-6、JUN、PTGS2、VEGFA等5個靶標。分別得到兩兩間的分子對接結合自由能(表2)，發現AKT1-Diosgenin、PTGS2-Diosgenin、PTGS2-Kaempferol、PTGS2-Luteolin、PTGS2-Quercetin的結合能均<-9 kcal/mol，而IL-6-Diosgenin、AKT1-Kaempferol、AKT1-Luteolin、AKT1-Quercetin、AKT1- Wogonin、AKT1-Baicalein的結合能均<-8 kcal/mol。最后構建出AKT1-Diosgenin、PTGS2-Diosgenin、PTGS2-Kaempferol、PTGS2-Luteolin、PTGS2-Quercetin的分子對接模式(圖7)。

表2 化合物與蛋白靶標的結合能 kcal/mol

其中Diosgenin與AKT1蛋白對接中，該化合物與周圍蛋白殘基主要是疏水作用。Baicalein與PTGE2蛋白的對接中，該化合物與周圍蛋白殘基也主要是疏水作用。Luteolin與PTGE2蛋白的對接中，該化合物與周圍蛋白殘基的Ile408、Gln406、Gln405氨基酸成氫鍵作用，與Leu283等成疏水作用。

A： AKT1與薯蕷皂苷元； B： PTGS2與黃芩素； C： PTGS2與薯蕷皂苷元； D： PTGS2與山柰酚； E： PTGS2與木犀草素； F： PTGS2與槲皮素圖7 涼血消斑湯核心成分與PTGS2和AKT1的分子對接模式

3 討論

在尋常型銀屑病中醫證素診斷量化研究中，血熱證占主導地位，且與血分息息相關[9-10]。銀屑病急性期表現具有明顯血熱證特征：皮疹色紅，發展迅速，鱗屑多，點狀出血明顯，伴瘙癢，常伴咽痛、口渴、便干、溲赤、易怒、舌紅絳、苔薄黃和脈弦滑等。急性發病期的銀屑病患者呈現進行性發展的炎性丘疹、基底浸潤明顯及明顯的出血現象[11]。因此，清熱涼血法成為銀屑病重要的治療思路之一。本研究所選涼血消斑湯以清氣法為主，佐以涼血，在涼血的基礎上清熱透熱于外，清血熱以透外疹。但涼血消斑湯治療銀屑病的機制尚不清楚，阻礙了該方的進一步開發與應用，本研究通過網絡藥理學與分子對接結合的模式對其可能機制進行初步探討與驗證。

在該項研究中，通過PPI網絡獲得涼血消斑湯治療銀屑病的核心靶標，如INS、AKT1、IL-6、VEGFA、MYC、EGFR、JUN、MAPK、CASP3、PTGS2等。其中大多數靶標已被證實在銀屑病的各種病理改變中起重要作用，如IL-6、PTGS2參與異常的炎癥因子分泌與炎癥細胞誘導[12-14]，VEGF是目前所知最重要的生理和病理狀態下血管新生的調節因素[15-16]，AKT、MAPK、CASP3、JUN的細胞自噬與細胞凋亡相關功能與成纖維細胞的過度增殖有關[17-18]。許多研究證實銀屑病的發生可能與胰島素抵抗有密切聯系[19-20]。在得到PPI核心靶標的基礎上，結合調控靶點數和對應化合物數目排序在前的有效成分和靶點，篩選出9個成分與6個靶標，兩兩進行分子對接，結果顯示，AKT1-薯蕷皂苷元、PTGS2-薯蕷皂苷元、PTGS2-山柰酚、PTGS2-木犀草素、PTGS2-槲皮素之間表現出理想的結合能力，涼血消斑湯可能是通過薯蕷皂苷元、山柰酚、木犀草素及槲皮素等有效成分，干預AKT1及PTGS2等靶標，從而影響下游通路，繼而改善銀屑病。富集分析結果表明，銀屑病中的白細胞介素信號、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路可能是該方治療銀屑病發揮主要功能的途徑。另外，涼血消斑湯還可通過調節細胞凋亡與死亡、血管發育和細胞黏附等生物學功能來干預銀屑病。血管新生是銀屑病的重要病理環節，VEGF是目前所知最重要的生理和病理狀態下血管新生的調節因素，銀屑病患者皮損區VEGF水平較非皮損區及正常皮膚明顯增高[21-22]。銀屑病的發病與角質形成細胞的凋亡情況密切相關，但是凋亡的促進或抵抗在銀屑病中仍沒有統一結論[23]。另外，銀屑病患者的微脈管系統經歷形態學改變后，淋巴細胞通過黏附分子黏附到內皮細胞，穿過內皮完成淋巴細胞遷移，細胞黏附的發生是皮損中炎性細胞聚集的重要因素[23]。

根據基因表達譜，在銀屑病患者皮膚中，PGE2信號通路和IL-23/Th17通路呈正相關。IL-23是Th17細胞產生和維持IL-17所必需的，其誘導Th17細胞的PTGS2編碼COX2，產生PGE2，PGE2作用于這些細胞的PGE受體,從而放大其上游的IL-23信號，PGE2同時也可誘導多種炎癥相關基因的表達[25-26]。結合通路富集與分子對接結果，將IL-17與PI3K-Akt作為涼血消斑湯可能發揮作用的兩條重要信號通路。銀屑病的發生及病情嚴重程度與IL-23/Th17/IL-17軸相關細胞因子的高表達有關[27-28]。自噬在銀屑病等自身免疫疾病中主要起四個作用，即去除胞內病原體，淋巴細胞發育，促炎信號傳導和分泌途徑[29-30]。激活PI3K/AKT抑制自噬被認為是治療IL-17A介導的銀屑病的一種治療方法[31]，而IL-23通過活化AKT/mTOR信號通路抑制細胞自噬活性[32]。涼血消斑湯可能通過炎癥和自噬兩個方面治療和緩解銀屑病。

在篩選出的涼血消斑湯重要有效成分中，薯蕷皂苷元已被證實抑制HaCaT角質形成細胞的生長，下調促炎因子，并抑制血管形成，減輕咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型[33]。山柰酚可減少銀屑病皮損中包括IL-17A在內的主要促炎因子，并可降低銀屑病樣小鼠的脾臟和淋巴結中的IL-17A+CD4+T細胞百分比[34]。木犀草素能減輕銀屑病皮膚病變，抑制巨噬細胞、T細胞和中性粒細胞在表皮的浸潤，并降低皮損中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-23和IL-17A等細胞因子的表達[35]。槲皮素可通過NF-κB通路在咪喹莫特誘導的小鼠中發揮抗銀屑病作用，其潛在機制可能是抗氧化劑和抗炎狀態的改善以及對NF-κB信號傳導的抑制[36]。現代藥理學研究證明，黃芩素具有抗炎及免疫調節功能，在甲型流感中能降低TNF-α、IL-6水平來調節炎癥反應[37]。但關于這些單體與AKT1、PTGS2及IL-17通路、PI3K-Akt通路的相關實驗研究較少，有待進一步探索。

綜上，涼血消斑湯治療血熱型銀屑病可能是通過PTGS2、AKT1等靶標對IL-23/Th17軸相關因子水平的調節及機體自噬水平的干擾來實現的。目前通過網絡藥理學和分子對接的研究，仍然無法確定涼血消斑湯對這些途徑的抑制或者激活作用。可以通過部分活性成分的前期實驗結果推斷涼血消斑湯可能通過抑制或激活白細胞介素信號、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路來達到治療作用。通路的具體調控過程有待后續實驗研究進一步驗證。