大刺鰍不同組織乳酸脫氫酶及酯酶同工酶研究

徐先棟，王海華，李燕華，吳 斌，馬本賀，曾慶祥

（1. 江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039；2. 贛州市水產(chǎn)研究所，江西 贛州 341199）

大刺鰍（Mastacembelus armatus），屬于鱸形目 （Perciformes）[1]，也有學(xué)者通過(guò)分子標(biāo)記分類鑒定結(jié)果， 認(rèn)為大刺鰍屬于合鰓目[2-3]，刺鰍科（Mastacembelidae）、刺鰍屬（Mastacembelus），俗稱辣錐、石錐、刀鰍、粗麻割、鐮刀魚等，主要分布于我國(guó)東南地區(qū)，是一種小型淡水魚類，棲息于有石塊的江河底層，或岸邊有水草的深潭石縫處[4]。其肉質(zhì)鮮美，富含氨基酸和礦物元素[5]。該魚因其外觀特殊，體表有棘刺，原來(lái)不受市場(chǎng)重視，關(guān)注較少，近年來(lái)，隨著人們對(duì)該物種認(rèn)識(shí)的不斷提高，加上其本身肉嫩味佳，無(wú)肌間刺，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，其良好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值日益得到體現(xiàn)。目前對(duì)大刺鰍的遺傳生物學(xué)如核型、線粒體遺傳多態(tài)性等有少量的報(bào)道，如李芬等[6]對(duì)屬珠江水系干流的北江大刺鰍核型及線粒體基因的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，對(duì)大刺鰍的同工酶研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道，為此筆者采集江西省信豐縣桃江水域大刺鰍進(jìn)行了同工酶研究，旨在豐富大刺鰍的遺傳生物學(xué)數(shù)據(jù)，為大刺鰍的種質(zhì)資源保護(hù)以及開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大刺鰍采自江西省信豐縣桃江水域。魚體體長(zhǎng)約25 cm，體重55 g 左右，充氧運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，并在玻璃缸中充氣暫養(yǎng)，缸底放置直徑為5 cm，長(zhǎng)度為30 cm 的聚乙烯管，為大刺鰍提供棲息和隱蔽場(chǎng)所，每天投喂鮮活小雜魚一次，暫養(yǎng)一周后，魚狀態(tài)正常，采樣試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶液提取 取大刺鰍肝臟、脾臟、肌肉、腎臟、心臟和腦6 種組織少許，雙蒸水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，置于離心管中，按1 ∶3（W/V）加入0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH 值7.0），首先使用消毒后的手術(shù)剪把組織剪成小塊，然后再使用電動(dòng)研磨器冰浴研磨成勻漿狀。完成后于4℃下10 000 r/min 離心30 min，吸取上清液，-20℃儲(chǔ)存，盡快用于電泳分析。

1.2.2 電 泳采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酞胺凝膠電泳法，電泳系統(tǒng)為NuPAGE Bis-Tris蛋白預(yù)制膠套裝，包括invitrogen Mini Gel Tank 小型電泳槽，NuPAGE 蛋白預(yù)制梯度凝膠（濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%）NuPAGE LDS Sample buffer 緩沖液。20 μL 樣品與2 μL 指示劑溴酚蘭混合一起上樣，首先使用80 V電泳至樣品壓縮成一細(xì)線并跑出濃縮膠后，調(diào)大電壓至120 V 繼續(xù)進(jìn)行分離膠電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)的邊緣到達(dá)凝膠底部時(shí)，停止電泳，整個(gè)電泳過(guò)程約30 min。

凝膠電泳完畢后立即取下，用雙蒸水漂洗干凈，置于染色液中于37℃染色，染色方法參照國(guó)標(biāo)進(jìn) 行[7]，染色完成后，用雙蒸水漂洗干凈，保存于7%醋酸中。用數(shù)碼相機(jī)及伯樂(lè)（Bio-Rad）凝膠成像系統(tǒng) （Gel Doc XR+）拍攝同工酶圖譜。

同工酶的命名方法參照徐先棟等方法進(jìn)行[8]。以向陽(yáng)極方向泳動(dòng)最快的編為1 號(hào)，依次各酶帶分別編為2、3、4……n 號(hào)。重復(fù)試驗(yàn)2 次。同工酶在各組織中的含量以示意圖中條帶粗細(xì)及顏色深淺來(lái)表示，條帶粗、顏色深表示酶的含量高。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸脫氫酶酶譜表型

大刺鰍乳酸脫氫酶同工酶共檢測(cè)到5 條酶帶，在肌肉中均能檢測(cè)到5 條，在肝臟中檢測(cè)到4 條，在脾臟、腎臟及心臟檢測(cè)到1 條，腦組織中未檢測(cè)到乳酸脫氫酶表達(dá)（圖1）。在肝臟中乳酸脫氫酶表達(dá)活性最高。

2.2 酯酶酶譜表型

大刺鰍酯酶同工酶共檢測(cè)到6 條酶帶，在肌肉中檢測(cè)到4 條，肝臟、脾臟、腎臟和心臟中均檢測(cè)到2 條，腦組織中檢測(cè)到1 條（圖2）。在肝臟中酯酶表達(dá)活性最高，其次為腎臟、脾臟。

圖1 大刺鰍不同組織乳酸脫氫酶電泳圖譜及酶譜示意圖

圖2 大刺鰍不同組織酯酶電泳圖譜及酶譜示意圖

3 討 論

乳酸脫氫酶（LDH）是研究最早也是比較深入的一種同工酶，它是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，在氧氣充足的組織中，如心臟中催化乳酸脫氫氧化為丙酮酸，參與三羧酸循環(huán)[9]，在厭氧器官組織中，如肝臟、肌肉組織中催化丙酮酸還原為乳酸。研究表明，魚類LDH 同工酶是由多基因決定的，分布存在明顯的組織特異性[10]。LDH 同工酶一般由M 和H 蛋白亞基組成，LDH-M、LDH-H基因表達(dá)形成四聚體，從陰極到陽(yáng)極依次排列為M4（LDH5）、M3H（LDH4）、M2H2（LDH3）、MH3（LDH2）、H4（LDH1）5 種組合方式，表現(xiàn)為5 條酶帶[9]。研究在大刺鰍肌肉中檢測(cè)到LDH5 種同工酶，在其他組織中分別檢測(cè)到0～3條不等，表明大刺鰍的LDH 同工酶存在明顯的組織差異性。在肌肉和肝臟嫌氣性組織中酶活最強(qiáng)，表明同工酶催化丙酮酸還原為乳酸的反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，與大刺鰍習(xí)性溫和，棲息于礫石底的江河溪流中，常藏匿于石縫或洞穴中低氧環(huán)境相適應(yīng)。

另外，在多數(shù)二倍體魚類中，LDH 同工酶表現(xiàn)為M、H 基因編碼的M、H 亞基構(gòu)成的5 條譜帶[11]，由此可以推測(cè)大刺鰍應(yīng)為二倍體魚類。此外，大刺鰍不同組織乳酸脫氫酶中，肌肉組織中5 條帶表達(dá)穩(wěn)定，腦組織中無(wú)LDH 條帶，這2 種組織可作為大刺鰍種質(zhì)鑒定的標(biāo)志酶取樣部位。

酯酶屬于水解酶類，能催化酯健水解，目前酯酶的遺傳基礎(chǔ)和亞基組成尚無(wú)定論，一般認(rèn)為在硬骨魚類中EST 是單體或二聚體，由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼，多態(tài)現(xiàn)象普遍[12]。研究結(jié)果同此結(jié)論相似，大刺鰍各組織中酯酶的分布具有多態(tài)性。研究大刺鰍酯酶在肝臟中表達(dá)活性最強(qiáng)，腎臟次之，同李雅娟等[13]研究黃顙魚體內(nèi)酯酶結(jié)果相類似。肝臟是重要的解毒器官，主要起解毒作用的就是酯酶，酯酶除了維持細(xì)胞正常的能量代謝外，還能水解大量非生理性存在的酯類化合物，認(rèn)為可能與機(jī)體的解毒作用密切相關(guān)，大刺鰍肝臟中的酯酶含量豐富，與肝臟的解毒功能是相適應(yīng)的。腎臟是重要的排泄器官，肝臟分解的有毒物質(zhì)通過(guò)腎臟排出體外，因而與之相適應(yīng)其酯酶同工酶亦表現(xiàn)出活力強(qiáng)的酶帶。肌肉組織功能相對(duì)單一，酶譜帶表達(dá)穩(wěn)定，如研究大刺鰍肌肉組織中4 條酶帶，表達(dá)穩(wěn)定清晰，且不同于其他組織，具有特異性，與LDH同工酶一樣，可以作為大刺鰍種植鑒定的標(biāo)志酶取樣部位。