桉樹輪斑病原菌生物學特性分析

廖旺姣，鄒東霞，羅 輯，鐘雅婷，吳耀軍，黃乃秀，黃華艷

（廣西壯族自治區林業科學研究院 廣西優良用材林資源培育重點實驗室廣西林業有害生物天敵繁育工程技術研究中心，廣西南寧 530002）

桉樹（Eucalyptusspp.）是世界速生豐產造林樹種之一，具有生長快、伐期短、產量高、用途廣和效益好等優點，已成為我國南方重要的用材林樹種和優良的綠化樹種。廣西桉樹人工林發展迅速，從2000年的近15 萬hm2發展到2013年最高峰的200 多萬hm2。由于經營管理不當，且純林面積不斷擴大，桉樹有害生物種類不斷增多，危害面積增加，災害日趨嚴重[1-4]。輪斑病是目前危害桉樹葉片的重要病害，可引起葉片大面積枯死，嚴重時，整株桉樹80%葉片出現干枯，林地發病率可達100%，嚴重影響桉樹的生長和木材蓄積[5]。關于輪斑病的研究，目前主要集中在病原方面，黃翠流等[6]確定Pili?diella eucalyptorum和P.diplodiella為廣西桉樹輪斑病原菌，其中P.eucalyptorum主要危害桉樹幼林及成林葉片，P.diplodiella主要危害苗期葉片。關于病原菌基本生物學特性尚未見報道。本研究分析P.eucalyptorum在不同營養和理化環境條件下的培養特性，旨在為桉樹輪斑病發病規律和防治技術研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗供試菌株為P.eucalyptorum，由廣西壯族自治區林業科學研究院森林保護研究所提供。

1.2 生物學特性研究

1.2.1 病原菌培養

將供試菌株從4 ℃冰箱取出，挑取菌絲接種在PDA 平板培養基（馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂粉18.00 g 和水1 000 mL）中央[6]，置于25 ℃恒溫箱暗培養6天，待菌落生長至近培養皿邊緣，用滅菌打孔器（內徑為6 mm）在菌落邊緣打取菌塊，備用。

從桉樹林地采集產孢的典型輪斑病病葉，用流動自來水沖洗干凈，75%酒精消毒表面，無菌水沖洗3次，然后用解剖刀刮下分生孢子，放入滅菌培養皿中，使用PDB 培養液（馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g 和水1 000 mL）梯度配置分生孢子液，濃度為2.00×106個孢子/mL，備用。

1.2.2 溫度對菌絲生長的影響

設置5、10、15、20、25、28、30、35 和40 ℃九個溫度梯度，將菌塊接種至PDA 平板中央，分別放置于上述9 種溫度的恒溫箱中進行恒溫暗培養，培養5天后用十字交叉法測量菌落直徑，每個溫度處理6個重復。

1.2.3 pH對菌絲生長的影響

制備PDB培養液，pH設置為2 ～12，間隔為1，用1 mol/L的HCl和NaOH調配，接種3塊菌塊至上述培養液中，不同pH 值培養液設置3個重復。培養條件為120 r/min、28 ℃。震蕩培養10天后，用100目紗網過濾收集菌絲，80 ℃烘干至恒重后稱量菌絲干重[7]。

1.2.4 光照對菌絲生長的影響

參考賴傳雅等[8]的試驗方法并略作修改，在PDA 平板中央接種直徑6 mm 的菌塊，待菌落生長到直徑30 ～40 mm后，分別置于全程暗處理、12 h光暗交替（40 W，燈皿距離20 cm，下同）、6 h/18 h 光暗交替（40 W）、全程光照（40 W）、紫外光12 h 光暗交替（20 W）、紫外光6 h/18 h 光暗交替（20 W）和全程自然光7 種光照條件，25 ℃恒溫培養，培養6 天后測量菌落直徑，測量方法同1.2.2。

1.2.5 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

基礎培養基為Czapek 培養基[7]，以等質量的乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉、阿拉伯樹膠粉、甘露醇、D-山梨醇置換其中的蔗糖，配置不同碳源培養基；以等質量的蛋白胨、酵粉、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、尿素、甘氨酸、DL-甲硫氨酸、DL-天門冬酰胺氮置換其中的硝酸鈉，配置不同氮源培養基。平板中央接種6 mm 菌塊，置于25 ℃恒溫箱中暗培養，每種碳、氮源為1 個處理，每處理6 個重復，培養6 天后測量菌落直徑，測定方法同1.2.2。

1.2.6 溫、濕度對分生孢子萌發的影響

用移液器吸取適量的分生孢子液至凹面玻片，放入滅菌培養皿中，用保鮮袋包扎好，置于1.2.2 設置的溫度梯度恒溫箱中培養，96 h 后在40×10 倍顯微鏡下鏡檢，觀察并記錄分生孢子萌發數量，隨機記錄100個分生孢子中萌發孢子數，每個溫度處理6個重復。

用移液器吸取適量的孢子液均勻涂抹于滅菌載玻片上，快速陰干后，分別放入相對濕度為100%+水滴、100%、90%、85%、75%、65%和50%的七個小容器中[7]，不同處理重復3次。25 ℃保濕培養96 h后鏡檢其孢子萌發數[9]

1.2.7 菌絲體和分生孢子致死溫度測定

參考江正君等[10]試驗方法并略作修改，分別挑取培養6 天的菌絲和刮取病斑上的分生孢子，用無菌水制成懸浮液，分生孢子濃度為2.00 × 106個孢子/mL，分別用移液器吸取4 mL 至滅菌的試管（15.0 mm × 150.0 mm）中，置于40 ～60 ℃（梯度為2 ℃）恒溫水浴中處理10 min，迅速冷卻，然后用移液器分別吸取0.2 mL 菌絲體懸浮液和分生孢子液放入PDA 平板培養基上，用滅菌三角玻棒均勻涂布，每處理3 個重復，25 ℃培養6 天后檢查菌絲生長和分生孢子萌發情況。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對菌絲生長的影響

不同溫度處理的菌落直徑差異顯著（P＜0.05），菌絲在10 ～35 ℃均能生長，低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌絲生長（表1）。28 ℃時菌絲生長最快，菌落直徑為83.58 mm，是菌絲最合適的生長溫度；其次是25 ℃，菌落直徑為73.38 mm。溫度高于28 ℃時，菌絲生長急劇下降，30 ℃的菌落直徑為32.35 mm，較28 ℃菌落直徑小51.23 mm，說明高溫不利于菌絲生長。

表1 不同溫度對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.1 Effects of different temperatures on mycelial growth of P.eucalyptorum

2.2 不同pH值對菌絲生長的影響

不同pH 處理的菌絲干重差異顯著（P＜0.05）（表2）。菌絲在pH 2 ～12 環境下均能生長，pH 為6時菌絲干重最重，說明該菌在弱酸性的條件下生長最好，其次是pH 5和7。菌絲在強堿條件下（pH 10、11 和12）生長較差，在強酸性條件下（pH 2 和3）生長也較差。說明強酸或強堿不利于菌絲生長。

表2 不同pH處理對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different pH values on mycelial growth of P.eucalyptorum

2.3 不同光照條件對菌絲生長的影響

菌絲在6 h/18 h 紫外光光暗交替處理下生長速度最快，菌落直徑為82.03 mm，其次為12 h 光暗交替處理，菌落直徑為78.29 mm，與其他處理差異顯著（P＜0.05）；全光照、6 h/18 h 光暗交替和自然光照處理的菌落直徑分別為71.78、67.19和63.21 mm；全黑暗處理的菌絲生長速度最慢，菌落直徑為36.15 mm（表3）。

表3 不同光照條件對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.3 Effects of different light conditions on mycelial growth of P.eucalyptorum

該菌在紫外光光暗交替處理下，6 h/18 h光暗交替處理菌絲生長比12 h 光暗交替處理要快，說明短時間紫外光處理有利于菌絲生長，長時間處理則不利于菌絲生長。日光燈處理時，6 h/18 h光暗交替處理下的菌落直徑比12 h 光暗交替處理要小；12 h 光暗交替和全光照處理相比，菌絲生長較快，說明適度的日光燈處理有利于菌絲生長。

2.4 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

菌絲在不同碳源條件下均能生長，在乳糖和蔗糖培養基中生長快，菌落直徑分別為76.88 和76.85 mm，與山梨醇處理外的其他處理差異顯著（P＜0.05），說明這兩種碳源適合菌絲生長；其次為D-山梨醇和D-葡萄糖，菌落直徑分別為74.62 和73.95 mm；在阿拉伯樹膠粉培養基上生長最慢，菌落直徑為55.22 mm，說明阿拉伯樹膠粉不適合菌絲生長（表4）。

表4 不同碳、氮源對桉樹輪斑病原菌菌絲生長的影響Tab.4 Effects of different carbon sources and nitrogen sources on mycelial growth of P.eucalyptorum

菌絲在蛋白胨和酵母粉培養基上生長快，菌落直徑分別為81.59和79.48 mm，與其他氮源處理差異顯著（P＜0.05）；其次為硝酸鈉培養基，菌落直徑為59.64 mm；在尿素培養基上菌絲生長最差，直徑為6.27 mm，幾乎不生長，說明尿素會抑制菌絲生長。

2.5 不同溫、濕度對分生孢子萌發的影響

分生孢子在20 ～30 ℃均可萌發，28 ℃時萌發率最高（72%）；其次為25 ℃（48.67%）；低于20 ℃和高于30 ℃，分生孢子不萌發（表5）。與菌絲生長結果相似，溫度高于28 ℃，分生孢子萌發率急劇下降，30 ℃時僅為20.00%，較28 ℃時低52.00%。

表5 溫度對桉樹輪斑病原菌分生孢子萌發的影響Tab.5 Effects of different temperatures on conidia germination of P.eucalyptorum

桉樹輪斑病原菌分生孢子在100%+水滴的條件下萌發率最高（62.00%），其次是相對濕度100%條件，萌發率為10%，在相對濕度低于100%的條件下均不能萌發，說明該菌分生孢子萌發對濕度要求較高（表6）。

表6 不同相對濕度對桉樹輪斑病原菌分生孢子萌發的影響Tab.6 Effects of different relative humidity conditions on conidia germination of P.eucalyptorum

2.6 致死溫度測定

菌絲經40、42、44 和46 ℃處理10 min 后，在PDA 平板培養基培養6 天后仍然能生長，隨著溫度升高，菌絲生長量減少，經48、50、52、54、56、58 和60 ℃處理的菌絲不能生長。分生孢子經過40、42、44、46 和48 ℃處理10 min 后，在PDA 平板培養基培養6 天后仍能萌發，長出菌絲，隨著溫度升高，萌發率降低；50、52、54、56、58 和60 ℃處理10 min 后，在PDA 平板培養6 天沒有長出菌絲。因此，本試驗確定該病原菌菌絲的致死溫度為48 ℃，分生孢子致死溫度為50 ℃。

3 結論與討論

病原菌生物學特性是病害早期診斷、預測與防治的基礎[11-12]。桉樹輪斑病原菌P.eucalyptorum的生物學特性目前國內外未見報道。本研究結果表明，P.eucalyptorum菌絲在10 ～35 ℃均能生長，最適生長溫度為28 ℃，低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌絲生長；分生孢子在20 ～30 ℃均可萌發，以28 ℃萌發率最高；分生孢子在飽和濕度且有水滴條件下萌發效果最好。這與廣西桉樹輪斑病發生規律相符。3—4月溫度較低、雨水較多、濕度較大，越冬病原菌開始活躍，5—8月溫、濕度較高，病害迅速擴展蔓延至高峰，9—11月持續高溫或者連續晴天，病斑擴展緩慢或停止。說明溫、濕度是影響林間病害發生和流行的主要因素。菌絲pH 生長范圍為2 ～12，最適pH 為6，說明弱酸環境有利于菌絲生長，這與方中達[7]報道的真菌對培養基pH 值最適度為3 ～6 的結果相一致。菌絲在以乳糖和蔗糖作為碳源的培養基中生長最佳，阿拉伯樹膠粉培養基中生長較差；氮源利用方面，菌絲在蛋白胨和酵母粉培養基中生長最佳，尿素培養基中生長最差。合理使用氮肥能增強桉樹抗病性，減少病害發生，間接達到防治病害的目的，這與王義勛等[13]報道的油茶炭疽病病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）生物學特性得出的結論相同。光照能加速該菌菌絲生長，不同光照及時間處理結果有差異。該菌菌絲和分生孢子對溫度敏感性存在差異，菌絲的致死溫度為48 ℃，分生孢子致死溫度為50 ℃，表明該菌的致死溫度較高。本研究結果表明桉樹輪斑病原菌菌絲生長受溫度、pH 值、光照、碳源和氮源影響明顯，病原菌對環境的適應能力較強。

本研究通過生物學特性試驗基本明確了P.eu?calyptorum菌絲最適生長條件，該供試菌株在培養基上不產孢，且菌株衰退明顯，不利于后續研究，可對P.eucalyptorum的產孢條件進行研究。