桉樹輪斑病原菌生物學(xué)特性分析

廖旺姣，鄒東霞，羅 輯，鐘雅婷，吳耀軍，黃乃秀，黃華艷

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西林業(yè)有害生物天敵繁育工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530002）

桉樹（Eucalyptusspp.）是世界速生豐產(chǎn)造林樹種之一，具有生長(zhǎng)快、伐期短、產(chǎn)量高、用途廣和效益好等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)南方重要的用材林樹種和優(yōu)良的綠化樹種。廣西桉樹人工林發(fā)展迅速，從2000年的近15 萬hm2發(fā)展到2013年最高峰的200 多萬hm2。由于經(jīng)營(yíng)管理不當(dāng)，且純林面積不斷擴(kuò)大，桉樹有害生物種類不斷增多，危害面積增加，災(zāi)害日趨嚴(yán)重[1-4]。輪斑病是目前危害桉樹葉片的重要病害，可引起葉片大面積枯死，嚴(yán)重時(shí)，整株桉樹80%葉片出現(xiàn)干枯，林地發(fā)病率可達(dá)100%，嚴(yán)重影響桉樹的生長(zhǎng)和木材蓄積[5]。關(guān)于輪斑病的研究，目前主要集中在病原方面，黃翠流等[6]確定Pili?diella eucalyptorum和P.diplodiella為廣西桉樹輪斑病原菌，其中P.eucalyptorum主要危害桉樹幼林及成林葉片，P.diplodiella主要危害苗期葉片。關(guān)于病原菌基本生物學(xué)特性尚未見報(bào)道。本研究分析P.eucalyptorum在不同營(yíng)養(yǎng)和理化環(huán)境條件下的培養(yǎng)特性，旨在為桉樹輪斑病發(fā)病規(guī)律和防治技術(shù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)供試菌株為P.eucalyptorum，由廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所提供。

1.2 生物學(xué)特性研究

1.2.1 病原菌培養(yǎng)

將供試菌株從4 ℃冰箱取出，挑取菌絲接種在PDA 平板培養(yǎng)基（馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂粉18.00 g 和水1 000 mL）中央[6]，置于25 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)6天，待菌落生長(zhǎng)至近培養(yǎng)皿邊緣，用滅菌打孔器（內(nèi)徑為6 mm）在菌落邊緣打取菌塊，備用。

從桉樹林地采集產(chǎn)孢的典型輪斑病病葉，用流動(dòng)自來水沖洗干凈，75%酒精消毒表面，無菌水沖洗3次，然后用解剖刀刮下分生孢子，放入滅菌培養(yǎng)皿中，使用PDB 培養(yǎng)液（馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g 和水1 000 mL）梯度配置分生孢子液，濃度為2.00×106個(gè)孢子/mL，備用。

1.2.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

設(shè)置5、10、15、20、25、28、30、35 和40 ℃九個(gè)溫度梯度，將菌塊接種至PDA 平板中央，分別放置于上述9 種溫度的恒溫箱中進(jìn)行恒溫暗培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)溫度處理6個(gè)重復(fù)。

1.2.3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

制備PDB培養(yǎng)液，pH設(shè)置為2 ～12，間隔為1，用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)配，接種3塊菌塊至上述培養(yǎng)液中，不同pH 值培養(yǎng)液設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件為120 r/min、28 ℃。震蕩培養(yǎng)10天后，用100目紗網(wǎng)過濾收集菌絲，80 ℃烘干至恒重后稱量菌絲干重[7]。

1.2.4 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

參考賴傳雅等[8]的試驗(yàn)方法并略作修改，在PDA 平板中央接種直徑6 mm 的菌塊，待菌落生長(zhǎng)到直徑30 ～40 mm后，分別置于全程暗處理、12 h光暗交替（40 W，燈皿距離20 cm，下同）、6 h/18 h 光暗交替（40 W）、全程光照（40 W）、紫外光12 h 光暗交替（20 W）、紫外光6 h/18 h 光暗交替（20 W）和全程自然光7 種光照條件，25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)6 天后測(cè)量菌落直徑，測(cè)量方法同1.2.2。

1.2.5 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Czapek 培養(yǎng)基[7]，以等質(zhì)量的乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、D-麥芽糖、可溶性淀粉、阿拉伯樹膠粉、甘露醇、D-山梨醇置換其中的蔗糖，配置不同碳源培養(yǎng)基；以等質(zhì)量的蛋白胨、酵粉、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、尿素、甘氨酸、DL-甲硫氨酸、DL-天門冬酰胺氮置換其中的硝酸鈉，配置不同氮源培養(yǎng)基。平板中央接種6 mm 菌塊，置于25 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)，每種碳、氮源為1 個(gè)處理，每處理6 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)6 天后測(cè)量菌落直徑，測(cè)定方法同1.2.2。

1.2.6 溫、濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

用移液器吸取適量的分生孢子液至凹面玻片，放入滅菌培養(yǎng)皿中，用保鮮袋包扎好，置于1.2.2 設(shè)置的溫度梯度恒溫箱中培養(yǎng)，96 h 后在40×10 倍顯微鏡下鏡檢，觀察并記錄分生孢子萌發(fā)數(shù)量，隨機(jī)記錄100個(gè)分生孢子中萌發(fā)孢子數(shù)，每個(gè)溫度處理6個(gè)重復(fù)。

用移液器吸取適量的孢子液均勻涂抹于滅菌載玻片上，快速陰干后，分別放入相對(duì)濕度為100%+水滴、100%、90%、85%、75%、65%和50%的七個(gè)小容器中[7]，不同處理重復(fù)3次。25 ℃保濕培養(yǎng)96 h后鏡檢其孢子萌發(fā)數(shù)[9]

1.2.7 菌絲體和分生孢子致死溫度測(cè)定

參考江正君等[10]試驗(yàn)方法并略作修改，分別挑取培養(yǎng)6 天的菌絲和刮取病斑上的分生孢子，用無菌水制成懸浮液，分生孢子濃度為2.00 × 106個(gè)孢子/mL，分別用移液器吸取4 mL 至滅菌的試管（15.0 mm × 150.0 mm）中，置于40 ～60 ℃（梯度為2 ℃）恒溫水浴中處理10 min，迅速冷卻，然后用移液器分別吸取0.2 mL 菌絲體懸浮液和分生孢子液放入PDA 平板培養(yǎng)基上，用滅菌三角玻棒均勻涂布，每處理3 個(gè)重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)6 天后檢查菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同溫度處理的菌落直徑差異顯著（P＜0.05），菌絲在10 ～35 ℃均能生長(zhǎng)，低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌絲生長(zhǎng)（表1）。28 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑為83.58 mm，是菌絲最合適的生長(zhǎng)溫度；其次是25 ℃，菌落直徑為73.38 mm。溫度高于28 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)急劇下降，30 ℃的菌落直徑為32.35 mm，較28 ℃菌落直徑小51.23 mm，說明高溫不利于菌絲生長(zhǎng)。

表1 不同溫度對(duì)桉樹輪斑病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effects of different temperatures on mycelial growth of P.eucalyptorum

2.2 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同pH 處理的菌絲干重差異顯著（P＜0.05）（表2）。菌絲在pH 2 ～12 環(huán)境下均能生長(zhǎng)，pH 為6時(shí)菌絲干重最重，說明該菌在弱酸性的條件下生長(zhǎng)最好，其次是pH 5和7。菌絲在強(qiáng)堿條件下（pH 10、11 和12）生長(zhǎng)較差，在強(qiáng)酸性條件下（pH 2 和3）生長(zhǎng)也較差。說明強(qiáng)酸或強(qiáng)堿不利于菌絲生長(zhǎng)。

表2 不同pH處理對(duì)桉樹輪斑病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of different pH values on mycelial growth of P.eucalyptorum

2.3 不同光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在6 h/18 h 紫外光光暗交替處理下生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑為82.03 mm，其次為12 h 光暗交替處理，菌落直徑為78.29 mm，與其他處理差異顯著（P＜0.05）；全光照、6 h/18 h 光暗交替和自然光照處理的菌落直徑分別為71.78、67.19和63.21 mm；全黑暗處理的菌絲生長(zhǎng)速度最慢，菌落直徑為36.15 mm（表3）。

表3 不同光照條件對(duì)桉樹輪斑病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effects of different light conditions on mycelial growth of P.eucalyptorum

該菌在紫外光光暗交替處理下，6 h/18 h光暗交替處理菌絲生長(zhǎng)比12 h 光暗交替處理要快，說明短時(shí)間紫外光處理有利于菌絲生長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間處理則不利于菌絲生長(zhǎng)。日光燈處理時(shí)，6 h/18 h光暗交替處理下的菌落直徑比12 h 光暗交替處理要小；12 h 光暗交替和全光照處理相比，菌絲生長(zhǎng)較快，說明適度的日光燈處理有利于菌絲生長(zhǎng)。

2.4 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在不同碳源條件下均能生長(zhǎng)，在乳糖和蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)快，菌落直徑分別為76.88 和76.85 mm，與山梨醇處理外的其他處理差異顯著（P＜0.05），說明這兩種碳源適合菌絲生長(zhǎng)；其次為D-山梨醇和D-葡萄糖，菌落直徑分別為74.62 和73.95 mm；在阿拉伯樹膠粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，菌落直徑為55.22 mm，說明阿拉伯樹膠粉不適合菌絲生長(zhǎng)（表4）。

表4 不同碳、氮源對(duì)桉樹輪斑病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effects of different carbon sources and nitrogen sources on mycelial growth of P.eucalyptorum

菌絲在蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，菌落直徑分別為81.59和79.48 mm，與其他氮源處理差異顯著（P＜0.05）；其次為硝酸鈉培養(yǎng)基，菌落直徑為59.64 mm；在尿素培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最差，直徑為6.27 mm，幾乎不生長(zhǎng)，說明尿素會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)。

2.5 不同溫、濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在20 ～30 ℃均可萌發(fā)，28 ℃時(shí)萌發(fā)率最高（72%）；其次為25 ℃（48.67%）；低于20 ℃和高于30 ℃，分生孢子不萌發(fā)（表5）。與菌絲生長(zhǎng)結(jié)果相似，溫度高于28 ℃，分生孢子萌發(fā)率急劇下降，30 ℃時(shí)僅為20.00%，較28 ℃時(shí)低52.00%。

表5 溫度對(duì)桉樹輪斑病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.5 Effects of different temperatures on conidia germination of P.eucalyptorum

桉樹輪斑病原菌分生孢子在100%+水滴的條件下萌發(fā)率最高（62.00%），其次是相對(duì)濕度100%條件，萌發(fā)率為10%，在相對(duì)濕度低于100%的條件下均不能萌發(fā)，說明該菌分生孢子萌發(fā)對(duì)濕度要求較高（表6）。

表6 不同相對(duì)濕度對(duì)桉樹輪斑病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.6 Effects of different relative humidity conditions on conidia germination of P.eucalyptorum

2.6 致死溫度測(cè)定

菌絲經(jīng)40、42、44 和46 ℃處理10 min 后，在PDA 平板培養(yǎng)基培養(yǎng)6 天后仍然能生長(zhǎng)，隨著溫度升高，菌絲生長(zhǎng)量減少，經(jīng)48、50、52、54、56、58 和60 ℃處理的菌絲不能生長(zhǎng)。分生孢子經(jīng)過40、42、44、46 和48 ℃處理10 min 后，在PDA 平板培養(yǎng)基培養(yǎng)6 天后仍能萌發(fā)，長(zhǎng)出菌絲，隨著溫度升高，萌發(fā)率降低；50、52、54、56、58 和60 ℃處理10 min 后，在PDA 平板培養(yǎng)6 天沒有長(zhǎng)出菌絲。因此，本試驗(yàn)確定該病原菌菌絲的致死溫度為48 ℃，分生孢子致死溫度為50 ℃。

3 結(jié)論與討論

病原菌生物學(xué)特性是病害早期診斷、預(yù)測(cè)與防治的基礎(chǔ)[11-12]。桉樹輪斑病原菌P.eucalyptorum的生物學(xué)特性目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，P.eucalyptorum菌絲在10 ～35 ℃均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，低于10 ℃或高于35 ℃均不利于病原菌菌絲生長(zhǎng)；分生孢子在20 ～30 ℃均可萌發(fā)，以28 ℃萌發(fā)率最高；分生孢子在飽和濕度且有水滴條件下萌發(fā)效果最好。這與廣西桉樹輪斑病發(fā)生規(guī)律相符。3—4月溫度較低、雨水較多、濕度較大，越冬病原菌開始活躍，5—8月溫、濕度較高，病害迅速擴(kuò)展蔓延至高峰，9—11月持續(xù)高溫或者連續(xù)晴天，病斑擴(kuò)展緩慢或停止。說明溫、濕度是影響林間病害發(fā)生和流行的主要因素。菌絲pH 生長(zhǎng)范圍為2 ～12，最適pH 為6，說明弱酸環(huán)境有利于菌絲生長(zhǎng)，這與方中達(dá)[7]報(bào)道的真菌對(duì)培養(yǎng)基pH 值最適度為3 ～6 的結(jié)果相一致。菌絲在以乳糖和蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最佳，阿拉伯樹膠粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較差；氮源利用方面，菌絲在蛋白胨和酵母粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最佳，尿素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最差。合理使用氮肥能增強(qiáng)桉樹抗病性，減少病害發(fā)生，間接達(dá)到防治病害的目的，這與王義勛等[13]報(bào)道的油茶炭疽病病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）生物學(xué)特性得出的結(jié)論相同。光照能加速該菌菌絲生長(zhǎng)，不同光照及時(shí)間處理結(jié)果有差異。該菌菌絲和分生孢子對(duì)溫度敏感性存在差異，菌絲的致死溫度為48 ℃，分生孢子致死溫度為50 ℃，表明該菌的致死溫度較高。本研究結(jié)果表明桉樹輪斑病原菌菌絲生長(zhǎng)受溫度、pH 值、光照、碳源和氮源影響明顯，病原菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)。

本研究通過生物學(xué)特性試驗(yàn)基本明確了P.eu?calyptorum菌絲最適生長(zhǎng)條件，該供試菌株在培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，且菌株衰退明顯，不利于后續(xù)研究，可對(duì)P.eucalyptorum的產(chǎn)孢條件進(jìn)行研究。