抗仔豬腹瀉重組復合多價疫苗的抗原制備及其條件優化

張恒慧，尤建嵩，賀東亮，鄒棟良，趙肖瓊，李曉宇，李淑英，徐永平，*

（1. 太原工業學院環境與安全工程系，山西太原030008；2. 大連理工大學生物工程學院，遼寧大連116024；3. 大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧大連116023）

仔豬腹瀉影響畜牧業的發展，我國每年因仔豬腹瀉導致的死亡率約15%，造成的直接經濟損失達10 億元[1-2]。飼料行業使用大量的飼用抗生素防治仔豬腹瀉，導致一系列的細菌耐藥性、抗生素殘留等，從而影響國民健康和養殖業的高質量發展[3]。2020年，農業農村部已全面禁止飼料中添加抗生素藥物。用于防治仔豬腹瀉的新型“抗生素替代”方案的研究和應用已經迫在眉睫[4-5]。仔豬腹瀉的發病機理是由于產腸毒素大腸桿菌依賴菌毛黏附在腸道繼而大量增殖后分泌腸毒素引發的級聯反應[6-7]。因此，以腹瀉發生過程的兩大類抗原腸毒素和菌毛為作用靶點，通過疫苗產生相應抗體的手段可以有效地阻斷腹瀉的發生，是替代抗生素防治仔豬腹瀉的重要潛在方案之一[8]。

本團隊在前期的工作中將STa、STb 和LTB 3 種主要腸毒素基因重組連接，去掉腸毒素基因中編碼毒性結構域序列，有效保留表達免疫原性的序列，通過原核表達體系構建表達重組三價腸毒素SLS的重組菌[9]。本研究的在前期工作的基礎上，研發包含重組三價腸毒素抗原及主要菌毛抗原的復合多價疫苗的抗原的制備工藝條件、提高疫苗中抗原的純度以及降低抗原的制備成本，從而優化抗原的生產工藝，為疫苗后續的生產及臨床免疫試驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

三價腸毒素STa-LTB-STb 融合重組菌BL21 由大連理工大學ABTNL 實驗室提供；大腸桿菌F4ac 標準菌株C83902 由中國獸藥監察所提供；大腸桿菌F5 標準菌株C83914由中國獸藥監察所提供。

1.2 試驗試劑

改良Minca 培養基（青島海博生物技術有限公司）；TSB 培養基（美國Sigma 公司）；酵母粉、蛋白胨（英國Oxoid公司）；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（南京奧生化學技術有限公司）；N-三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、氨基乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、過硫酸銨（北京奧博星生物技術有限公司）；TEMED（美國Amresco 公司）；尿素（ultra）（加拿大Bio Basic Inc.）；二硫蘇糖醇（DTT）（中國醫藥上海化學試劑公司）；低分子量標準蛋白[寶生物（大連）有限公司]提供；硫酸卡那霉素（Kan）（浙江金華康恩貝生物制藥有限公司）。

TE1 緩沖液：10 mmol/L Tris·Cl（pH 值7.0）、1 mmol/L EDTA；TE2 緩 沖 液：50 mmol/L Tris·Cl（pH 值8.0）、10 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、100 mmol/L NaCl、0.5%TritonX-100；TE3 緩沖液：50 mmol/L Tris·Cl（pH 值8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、100 mmol/L NaCl、4 mol/L 尿素；包涵體溶解緩沖液A：50 mmol/L Tris·Cl（pH 值8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、100 mmol/L NaCl、8 mol/L 尿素、10 mmol/L DTT；包涵體溶解緩沖液B：50 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EDTA（pH值8.0）、50 mmol/L NaCl。

1.3 試驗儀器

TP600 型PCR 儀[寶生物工程（大連）有限公司]；10C型電泳儀、31D 型電泳槽、9405B 型脫色搖床（北京六一儀器廠）；PHS-3C 型精密pH 計（上海精密科學儀器）；0.45 μm 濾膜（Φ10 cm）（上海市新亞凈化器件廠）；5804R型低溫冷凍離心機（德國Eppendorf）；303-4A 型電熱恒溫培養箱（上海陽光實驗儀器公司）；FA1004型電子天平（上海越平科學儀器公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌毛蛋白PCR鑒定

根據表達ETEC 主要菌毛抗原的基因序列，從結構基因中選取保守序列作為目的片段，同時參考文獻報道，使用primer 5.0 設計F4 菌毛蛋白基因和F5 菌毛蛋白基因的PCR 引物[10]。上述引物的合成均由寶生物工程（大連）有限公司完成。不同菌毛蛋白基因PCR引物見表1。

表1 不同菌毛蛋白基因PCR引物Tab.1 PCR primers of different fimbria genes

分別將采樣的ETEC菌種和F4標準菌株進行純培養，菌懸液經過離心和PBS洗滌后獲得菌體沉淀，再加入超純水吸混均勻，在100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，迅速0 ℃冰浴5 min，4 ℃10000 r/min離心10 min，取上清，制備DNA模板[11]。采用20 μL PCR 體系，以各菌株DNA 為模板，分別采用F4菌毛蛋白和F5菌毛蛋白基因的特異性引物進行反應，PCR反應體系成分見表2。

為降低非特異性擴增，提高引物結合率，對PCR 反應條件進行了優化，具體PCR反應條件見表3。

PCR 結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳來對結果進行觀察。每個樣品取5 μL PCR 擴增產物與1 μL 6×loading buffer混勻后，上樣至1.5%的瓊脂糖凝膠，在100 V恒壓下電泳40 min。以DNA Marker DL2000為參照，紫外燈下觀察擴增片段的大小并分析結果。

1.4.2 重組三價腸毒素蛋白（SLS）的誘導表達、粗提和純化

將凍存的重組菌BL21 接種于含卡那霉素（Kan）濃度為25 mg/L 的LB 培養基在37 ℃恒溫搖床中活化培養12 h；將活化后的種子液以2%的接種量接種于含Kan（終濃度25 mg/L）的LB 培養基中37 ℃振蕩培養至菌懸液OD600nm為0.6左右時，根據培養液體積加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續培養菌體5 h左右，進行重組蛋白的誘導表達[12]。將重組蛋白誘導表達完全的菌液離心收集菌體細胞，加入等體積PBS緩沖液洗滌菌體，重復操作3次后在菌體沉淀中加入原菌液體積1/50倍的TE1緩沖液，吹打均勻至沒有凝塊，在冰水浴中將菌懸液超聲破碎30 min（破碎5 s、暫停5 s），將破碎混合液冷凍離心收集沉淀，即為SLS 重組蛋白粗提物。在重組蛋白粗提物中加入TE2 緩沖液進行洗滌純化，用移液槍吹洗均勻至沒有凝塊，在搖床上振蕩洗滌20 min，之后4 ℃、7000 r/min 離心20 min，收集沉淀；在沉淀中加入TE3 緩沖液，在搖床上振蕩洗滌20 min，隨后4 ℃、7000 r/min 離心20 min，收集純化后的重組蛋白沉淀[13]。

表2 PCR反應體系成分Tab.2 PCR system components

表3 PCR反應條件Tab.3 PCR reaction conditions

1.4.3 重組蛋白空間（三級及以上）結構和抗原性的恢復和方法優化

經過重組表達的蛋白質，在原核表達系統中以包涵體的形式存在，其天然構象被破壞，如若發揮重組腸毒素蛋白的免疫原性，需要經過體外變性和復性處理來恢復其空間結構和天然構象。將純化后的重組蛋白沉淀重懸至包涵體溶解緩沖A液中，漩渦振蕩混合均勻，于37 ℃搖床振蕩孵育使重組蛋白顆粒變性溶解；加入3倍體積的包涵體溶解緩沖B 液，用10 mol/L KOH 調節pH 值至9.8，室溫下靜置30 min 用濃HCl 將溶液pH 值調至8.0，室溫下靜置40 min 將溶解液離心取上清，4 ℃保存待用。包涵體蛋白在含有8 mol/L 尿素的溶解緩沖A 液的作用下，分子內氫鍵被破壞，二級以上空間結構發生改變，從而變性溶解。為恢復重組腸毒素的天然構象，需要除去其中添加的變性劑[14]。

本試驗分別對比研究常規透析方法以及多重優化方法對重組蛋白復性的效果。首先根據文獻報道，采用常規透析方法進行重組蛋白的復性，將變性溶解的重組蛋白溶液稀釋至0.5 g/L，依次加入尿素濃度為2.0、1.0、0.5、0 mol/L 4 個梯度的透析液中，4 ℃下透析復性，每個梯度持續12 h；最后兩次透析復性液中不加甘油，最終獲取純化、復性后的重組蛋白溶液，SDS-PAGE驗證并檢測純化、復性后重組蛋白及其純度，并用BCA法測取蛋白濃度[15]。

重組蛋白復性效果的好壞關系著重組蛋白能否有效恢復空間構象以及蛋白的純度、濃度和得率，直接影響后續疫苗使用的效果。在常規透析方法的基礎上，本試驗對復性條件進行優化，建立稀釋-透析-超濾離心多重去除尿素的方法，對重組蛋白進行復性，以提高重組蛋白的純度和得率。將重組蛋白稀釋溶液依次加入尿素濃度為6、4、2、1、0 mol/L 5個梯度的透析液中，4 ℃下透析復性，前4個梯度持續12 h，最后1個梯度持續24 h，再用截留分子量為3 kDa的超濾離心管在4 ℃、5000 r/min條件下對透析液離心處理10 min，檢測重組蛋白的純度和濃度。

1.4.4 F4菌毛蛋白的表達、提取和純化

本試驗分別采用改良Minca培養基、TSB培養基和LB培養基分別培養F4+標準菌株，考察培養基類型的不同對菌毛表達量的影響并且優化F4 菌毛的表達；菌毛的提取和純化采用熱振蕩法和等電點沉淀法，經過提純獲得純化的F4 菌毛蛋白。將F4+標準菌株依次接種于3 種培養基，37 ℃培養36 h 后離心收集菌體，用無菌PBS 溶液洗滌菌體，重復操作3次后將洗滌完成的菌液在60 ℃水浴中溫浴30 min，之后立即漩渦振蕩10 min，于11000 r/min 離心15 min 后取上清，用0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液即為F4菌毛粗提物[16]。用2.5%檸檬酸將菌毛粗提物調pH 值至3.92，4 ℃靜置2 h；4 ℃、11000 r/min離心30 min，棄上清，用無菌PBS溶解沉淀，重復操作3次后用SDS-PAGE檢測提取液中菌毛蛋白的含量及純度[17]。

1.4.5 F5菌毛蛋白的表達、提取和純化

采用F4菌毛蛋白優化后的方法研究F5菌毛蛋白的表達和提取過程。菌毛蛋白純化過程中，調節F5 菌毛蛋白粗提液pH 值為9.75，再靜置離心收集沉淀，最后用無菌PBS溶解沉淀獲得F5菌毛蛋白提取液，并檢測溶液中菌毛蛋白的含量及純度[18]。

2 結果與分析

2.1 菌毛類型的PCR檢測結果（見圖1、圖2）

圖1 F4菌毛基因擴增結果Fig.1 Results of PCR with F4 gene primer

圖2 F5菌毛基因擴增結果Fig.2 Results of PCR with F5 gene primer

由圖1可知，采用F4菌毛基因引物對幾株大腸桿菌進行PCR 擴增，電泳結果顯示F4+菌株在分量子約為817 bp處出現目的條帶，而F5+菌株卻未出現擴增產物，表明此基因為表達F4 菌毛蛋白抗原的基因，且為F4 菌株獨有的特異性抗原。由圖2可知，使用F5菌毛基因引物進行PCR擴增后，電泳結果顯示F5+菌株在480 bp處擴增出目的條帶，F4+菌株未出現擴增產物，表明此基因為表達F5 菌毛蛋白抗原的基因，且為F5+菌株獨有的特異性抗原。

2.2 SLS 誘導表達及提純的SDS-PAGE 檢測（見圖3、圖4）

由圖3 可知，對比IPTG 誘導表達前后的全菌電泳圖譜，外源基因經IPTG誘導表達后重組蛋白得到大量表達，通過超聲破碎獲得的重組蛋白以非水溶性的包涵體形式存在，含量占粗提物總蛋白的39.6%；采用常規方法對粗蛋白進行提純復性后重組蛋白水溶性增加，但是獲得的重組蛋白含量較低，經Gel-Pro Analyzer 4.0分析復性后的蛋白溶液中目的蛋白含量僅為11.2%，提純方法有待優化。

圖3 重組三價腸毒素蛋白SLS誘導表達及常規方法提純的電泳結果Fig.3 SDS-PAGE results of inducible expression and purification of SLS in routine method

由圖4可知，泳道6采用優化后的提純方法，重組蛋白的純度非常高且無雜帶，Gel-Pro Analyzer 4.0分析結果為接近100%，而且同體積菌懸液中重組蛋白的得率也比常規方法有所提高。

圖4 重組三價腸毒素蛋白誘導表達及提純的優化結果Fig.4 SDS-PAGE result of inducible expression and purification of SLS in optimized method

2.3 F4菌毛的表達和純化（圖5～圖7、表4）

在菌毛蛋白抗原的制備過程中，菌毛蛋白的表達量是影響蛋白收率的重要因素。由圖5可知，F4菌毛蛋白出現在全菌SDS-PAGE 電泳的28.1 kDa 條帶處，經Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件分析，在相同條件下使用改良Minca培養基培養的F4+標準菌株的F4菌毛表達量要高于LB培養基，計算得目的條帶的累積光密度（IOD值）在改良Minca 培養基全菌液中為9.44%高于LB 培養基中的6.61%；菌毛蛋白經溫浴、振蕩脫落離開菌體，獲得粗蛋白溶液，電泳結果顯示，改良Minca培養基培養的菌體制的粗提液中菌毛蛋白含量要遠高于LB培養基。由圖6可知，相同條件下改良Minca 培養基中全菌液目的蛋白含量為59.3%高于TSB 培養基中的48.0%，而且粗提物中菌毛蛋白的含量也更高。因此在改良Minca 培養基中生長的ETEC 菌株菌毛蛋白的表達量要高于LB 培養基和TSB 培養基，而且更利于菌毛蛋白的提取。

圖5 改良Minca培養基和LB培養基表達F4菌毛蛋白的對比效果Fig.5 Comparation of F4 proteins expressed in modified Minca broth and LB broth

圖6 改良Minca培養基和TSB培養基表達F4菌毛蛋白的對比效果Fig.6 Comparation of F4 proteins expressed in modified Minca broth and TSB broth

經過熱振蕩法制得的菌毛蛋白粗提液，采用等電點沉淀法對其進行純化。F4 菌毛蛋白純化過程的SDS-PAGE 結果見7。

圖7 F4菌毛蛋白的純化（改良Minca培養基）Fig.7 Purification of F4 protein cultured in modified Minca broth

由圖7 可知，F4 菌毛蛋白粗提液在pH 值為等電點4.0 下沉淀純化后，獲得純度很高的菌毛蛋白溶液，電泳結果顯示幾乎只有目的條帶。利用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件對F4 菌毛蛋白純化前后的SDSPAGE 結果進行分析，結果見表4。F4 菌毛蛋白目的條帶大小約為28.1 kDa，而且目的蛋白的純度由純化前的43.0%上升至純化后的約100%，純化效果良好。

表4 Gel-Pro Analyzer 4.0對F4菌毛蛋白純化分析結果Tab.4 Analysis of purification of F4 protein with Gel-Pro Analyzer 4.0

2.4 F5菌毛的表達和純化（見圖8）

根據幾種表達菌毛培養基的優化篩選結果，選用改良Minca 培養基培養F5+標準菌株來制備F5 菌毛蛋白抗原。利用熱振蕩法獲得的F5 菌毛蛋白粗提液，在其等電點9.75 下進行沉淀純化。由圖8a 可知，改良Minca 培養基中生長的F5 全菌電泳結果顯示，F5 菌毛蛋白的含量為20%，菌毛表達比較豐富；由圖8b 可知，等電點沉淀法獲得的F5 菌毛蛋白純化效果較好，制備了純度較高的F5 抗原蛋白。

圖8 改良Minca培養基培養標準F5+菌株以及菌毛蛋白的純化Fig.8 F5+ETEC cultivated in modified Minca broth and F5 protein purified

3 討論

目前，國內外已有的關于仔豬腹瀉疫苗大致可以分為：滅活或者減毒的全菌疫苗、菌毛蛋白單價或多價疫苗、類毒素疫苗、能夠重組表達單一或多種菌毛和腸毒素的基因工程疫苗及其他新興疫苗等[19]。無論何種類型的疫苗，其主要抗原還是菌毛和腸毒素。運用基因工程的手段，對幾種腸毒素基因進行改造，并導入受體細胞，獲得去掉腸毒素致病性并保留其免疫原性的重組腸毒素蛋白，可以作為制備多價疫苗腸毒素抗原的有效途徑[20]。再通過菌毛蛋白的高效表達、提取和純化，可以用來制備腸毒素菌毛復合疫苗的菌毛蛋白抗原。多價復合疫苗的免疫保護將針對腹瀉發生的細菌吸附和分泌毒素2個關鍵致病步驟，包含耐熱及不耐熱性腸毒素及主要菌毛類型的抗原，將探索預防不同類型ETEC致仔豬腹瀉的廣適性疫苗。

重組蛋白的表達、提取和純化是基因工程下游最關鍵的步驟，直接影響著能否獲得大量目的蛋白。以質粒為載體、大腸桿菌為宿主細胞的原核表達體系，通常在表達載體中使用lac啟動子，并且采用β-半乳糖苷酶的底物IPTG作為誘導劑，可以按照需求控制菌體的增殖和目的蛋白誘導表達的平衡，通過選取合適的誘導時間以及誘導劑用量，讓外源蛋白重組三價腸毒素得以大量的表達。外源蛋白經重組表達后以包涵體的形式存在于細胞內，需經破碎、離心后，再洗滌去除核酸、金屬離子等雜質后，溶解于尿素溶液中；在尿素作用下，重組表達的包涵體沉淀氫鍵被打開，三級結構和四級結構被破壞，溶解性增加；但是想要純化后的重組三價腸毒素具備免疫原性，需要除去尿素，恢復天然構象。文獻報道采用常規透析方法可以對重組蛋白進行純化除去尿素，但是本研究前期結果表明提純效率不夠高，方法有待優化。經過多次方法改進和試驗分析，建立了稀釋-透析-超濾離心多重去除尿素的方法，并且獲得較好的重組蛋白提純效果，方便疫苗抗原的制備[21]。

一個完整的大腸桿菌抗原成分復雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K）[22]。大腸桿菌表面生長的菌毛就是表面抗原的一種，在不同的培養基條件下，菌毛的表達和生長量有所不同。本研究采用幾種大腸桿菌常用的培養基LB培養基、TSB培養基及改良Minca培養基分別對ETEC菌株進行培養；對比相同培養條件下，不同培養獲得的菌毛蛋白的表達量有所不同。其中改良Minca培養基中培養的菌株菌毛的表達量最高，其他2種培養基獲得的菌毛表達量較差。從培養基配方的差異進行分析，改良Minca培養基中添加錳、鎂、鐵等微量元素，這些微量元素很有可能就是促進菌體表面菌毛蛋白表達量增加的原因。因此，在提取菌毛蛋白作為抗原的過程中，可以采用改良Minca培養基來培養菌體，以獲得表達量較大的菌毛蛋白。

4 結論

試驗結果表明，采用優化后的純化方法，能夠有效地提高重組三價腸毒素抗原制備過程中純度和產率；在制備菌毛抗原的過程中，使用改良Minca培養基來培養產腸毒素大腸桿菌，可以促使F4和F5菌毛蛋白更高效地表達；經恒溫振蕩、等電點沉淀提取純化的菌毛抗原蛋白純度較好，蛋白純度由粗蛋白的43%提高到約100%，為后續疫苗的制備和免疫效力的臨床試驗提供數據支持和技術參考。