2 株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定及S1 基因遺傳分析

施麗薇，高新樂，承 南，董彥鵬

（江蘇南農高科技股份有限公司，江蘇江陰214400）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性高度接觸性傳染病。雞通過吸入病毒或直接接觸污染物而感染，發病率通常為100%，表現為急性上呼吸道癥狀、產蛋數量和質量下降、腎炎等癥狀，嚴重影響養雞業的發展[1]。IBV是單股正鏈RNA 病毒，編碼的蛋白主要有S 蛋白（spike glycoprotein）、M蛋白、N蛋白等。其中S蛋白為纖突蛋白，可裂解為S1 和S2 亞基[2]。S1 亞基攜帶受體結合位點，影響病毒的組織嗜性[3]。S1 是中和性抗體和特異性抗體的主要誘導劑，在保護性免疫中也發揮著重要作用[4-5]。此外，S1 是IBV 中最易變異的基因，這種變異可能導致毒株間存在重要的生物學差異，因此常用該基因序列確定病毒基因型[6]。

IBV病毒基因組在復制過程中極易發生基因突變、缺失、插入及重組等，使IBV不斷發生變異，不同血清型之間交叉保護性較低[7]。研究顯示，我國目前流行的主要基因型為QX型，且毒株間重組現象非常普遍，促進病毒進化及新基因亞群的出現[8]。本研究于2020年6月從疑似發病雞場的病死雞體內分離到2株IBV毒株，對其S1基因進行遺傳分析及核苷酸同源性分析，以了解IBV 遺傳進化情況，為IBV的監測與防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

樣品采自安徽蚌埠某蛋雞養殖場送檢的疑似感染傳染性支氣管炎的病死雞。

1.1.2 雞胚及試劑

試驗所用SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

HiScript Q RT SuperMix for qPCR（R122-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；remix Taq?（TaKaRa Taq?Version 2.0 plus dye）（RR901A）、DL2000 DNA Marker（3427A）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；Z-10 Spin Column Viral Total RNA Extraction Kit（B158667）、Ezup Column Virus DNA Purification Kit（B518267）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 引物合成

傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克病毒、禽白血病病毒、呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 擴增引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 Sequence of PCR amplification primer

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒分離

采集氣管、心、肝、脾、肺、腎、法氏囊，按1∶5的比例加入滅菌PBS（pH 值7.2），經研磨處理，反復凍融3 次后8000 r/min離心5 min后取上清，經0.22 μm無菌濾器過濾除菌。將上述組織上清液經絨毛尿囊腔途徑接種10日齡SPF 雞胚，0.2 mL/胚，棄去24 h 內死亡雞胚，48～72 h 收取雞胚尿囊液繼續接胚，盲傳3 代，收集尿囊液，保存于-80 ℃備用。

1.2.2 PCR鑒定

提取盲傳后第3 代雞胚尿囊液DNA 和RNA，將RNA并進行反轉錄。將獲得的DNA 和cDNA 為模板進行PCR擴增。體系為25 μL：Premix Taq 12.5 μL、模板2 μL、上下游引物各1 μL、添加ddH2O 至總體積為25 μL。PCR 反應條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、35 s，54 ℃、35 s，72 ℃、50 s，循環30次；72 ℃、10 min，4 ℃保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切膠回收并送測。

1.2.3 序列測定與分析

對獲得的序列進行分析，從GeneBank 中下載IBV 各分支的S1基因序列作為本研究的參考。利用MEGA X軟件通過Clustal W進行序列比對，通過Neighbour-Joining法進行進化樹繪制；利用MegAlign 對分離株和各參考株的S1基因進行核苷酸同源性分析。

1.2.4 分離毒株EID50的測定

用滅菌PBS連續10倍倍比稀釋分離毒株雞胚尿囊液，每個稀釋度接種5枚10日齡雞胚，置于37 ℃孵化箱培養，棄去24 h 內死亡雞胚。144 h 取出雞胚觀察IBV 典型病變，表現為雞胚卷曲，發育不良，用Reed-Muench 法[9]計算EID50。

1.2.5 致雞胚矮小化試驗

將病毒尿囊液經尿囊腔接種5 枚10 日齡SPF 雞胚，0.1 mL/枚，并設置陰性對照組。對照組接種同樣劑量生理鹽水。將雞胚在37 ℃培養144 h，棄去24 h 內死亡雞胚，144 h 打開雞胚觀察胚體病變并稱重，經GraphPad Prism8計算體重平均值及差異。

2 結果與分析

2.1 病毒的分離與鑒定（見圖1）

由圖1 可知，用不同病毒的特異性引物對第3 代雞胚尿囊液進行PCR 檢測，結果僅IBV 為陽性，顯示大小約為1700 bp的條帶，其他病毒引物PCR結果均為陰性，表明雞胚尿囊液中存在IBV。經測序確定毒株序列，共分離到2株IBV，分別命名為AH01/2020和AH02/2020。

圖1 IBV分離株S1基因的PCR鑒定結果Fig.1 PCR identification of S1 gene of IBV

2.2 病毒S1基因的遺傳進化分析（見圖2、圖3）

由圖2、圖3可知，將IBV 分離株與GenBank 上的參考毒株S1 基因進行序列比對并繪制系統進化樹，可知分離株AH01/2020 為LSC/99I 型，AH02/2020 為QX 型。AH01/2020、AH02/2020 與參考株S1 基因的核苷酸相似性分別為76.7%～97.8%和78.1%～90.9%。2 株分離毒株與常用疫苗株H120、H52、M41、4/91、W93 的同源性普遍偏低，分 別 為 76.7%～78.3%、76.8%～78.1%、76.8%～78.6%、77.6%～79.4%以及77.1%～78.6%，表明使用傳統疫苗免疫并不能完全保護雞免于病毒感染。

圖2 基于IBV S1基因序列的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on IBV S1 gene sequence

圖3 基于IBV S1基因的核苷酸同源性分析Fig.3 Analysis of nucleotide homology based on IBV S1 gene

2.3 病毒對雞胚的致病力（見圖4、圖5）

由圖4、圖5 可知，根據胚體病變情況計算可得AH01/2020 株EID50為106.17/mL，AH02/2020 株EID50為1010.67/mL。將2株IBV分別感染SPF雞胚，144 h后可見胚體蜷縮、出血、發育不良等，呈卷曲胚胎，符合IBV 致雞胚病變的表現，感染雞胚病變極其明顯，而對照胚體無肉眼可見病變。與正常雞胚相比，2 株IBV 感染雞胚體重下降均極顯著（P<0.01）。

圖4 IBV毒株致雞胚病變Fig.4 Embryo lesions caused by IBV

圖5 雞胚胚體重量比較Fig.5 Weight compare of embryo

3 討論

傳染性支氣管炎呈世界性分布，可感染所有日齡的雞。感染雞生長緩慢、死淘率增加，給養雞業造成巨大經濟損失[10]。該病目前沒有特異性治療方法，主要通過改善飼養管理條件和疫苗接種來預防。理想的管理方法包括嚴格隔離、注重生物安全、減小飼養密度、消除冷應激、保證良好的通風等[11]。疫苗接種包括活疫苗和滅活疫苗[12]，目前我國主要應用H120、H52、M41 等毒株制備弱毒疫苗和活疫苗，以上毒株均屬于Mass型。但IBV突變率高，主要是由于該病毒特有的套氏轉錄方式及病毒RNA酶缺乏校正能力，還有自然選擇、免疫壓力等外在因素影響。此外，IBV血清型眾多，交叉保護能力較差[13]，常與其他病毒、細菌混合感染雞群[14-16]，且有研究顯示，近年來QX型IBV占據了優勢流行地位[17-19]，這些因素給疫苗防控帶來了巨大挑戰。

為進一步了解我國IBV毒株的遺傳變異情況，本試驗從安徽某蛋雞養殖場病死雞中分離到兩株病毒，接種雞胚可產生典型IBV 病變，經PCR 鑒定證實所分離的病毒為IBV。將分離的2株IBV毒株的S1基因與從GenBank下載的參考株進行序列比對，顯示2株病毒分屬于LSC/99Ⅰ型和QX 型，符合近年來QX 型為主要流行基因型的研究結果，LSC/99I型的流行也需進一步進行監測，同時應關注不同基因型IBV 混合感染的情況。2 株IBV 與疫苗株S1 基因的核苷酸同源性偏低，可能是由于長期使用活疫苗形成的免疫選擇壓導致。這種免疫選擇壓易導致野生毒株發生基因突變、重組等情況，從而產生新型野毒，使傳統疫苗的保護力下降[20]。因此，盲目使用IBV疫苗可能會導致新型變異毒株出現，需對IBV 進行持續的流行病學監測，尤其應注意多種基因型IBV 混合感染、共同流行的情況，為IBV防控和新疫苗開發提供參考。

4 結論

本試驗從蛋雞養殖場病死雞體內分離到2 株病毒，經雞胚接種、序列比對和進化樹繪制，可知2株病毒均可導致雞胚出現IBV 特征性病變，根據進化樹分析2 株病毒分屬于LSC/99I 和QX 分支，確定本次分離毒株為雞傳染性支氣管炎病毒。