巖羊多動物鏈球菌分離鑒定及藥酶試驗研究

張總超，闞 威，林元清，王云平

（青海省動物疫病預防控制中心，青海西寧810000）

近年來，由多動物鏈球菌引起動物感染后死亡的病例頻頻爆發，感染多種動物，并且傳染性強、病死率高。疫情感染較復雜，難以有效治愈，給畜牧業造成嚴重的經濟損失。多動物鏈球菌病是主要由鏈球菌屬，多動物鏈球菌引起的一種人畜共患病，是一種呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌。1999年，Devriese 等[1]首次從患有乳房炎的奶牛及生殖道和扁桃體、山羊及貓的扁桃體、金絲雀的嗉囊、呼吸道及綿羊和貓的扁桃體中分離出該菌，并得到分類命名。此外，Twomey 等[2]在羊駝與野雞體內也分得多動物鏈球菌。我國在2016年首次報道過山羊感染多動物鏈球菌病的病例，并成功從患羊鼻腔內分離得到優勢菌株[3]。2018年，王麗陽等[4-5]首次在國內分離出豬源性多動物鏈球菌。多動物鏈球菌導致人感染的病例屢有報道，曾從人類硬膜下膿腫液中分離到該細菌[6]。陸續多次報道的多動物鏈球菌感染事件，說明其危害不亞于鏈球菌屬其他型造成的危害。

近期，在青海省祁連縣境內發現一巖羊出現四肢乏力、行動困難、呼吸急促等癥狀，后經該縣動物疫控中心救治無果，最終死亡的病例。祁連縣工作人員及時無菌采集新鮮病料送至青海省動物疫病預防控制中心，中心工作人員對其進行細菌學診斷。按照描述的臨床癥狀疑似鏈球菌感染，通過直接觸片、染色鏡檢、分離純化培養等方式進行鑒定，發現該巖羊體內（肝、脾、肺）中存在有大量革蘭氏陽性鏈狀小球菌。進一步分離純化、生化鑒定、16S rRNA測序，并對分離株細菌S1進行藥敏試驗分析，以期對多動物鏈球菌病的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 待檢材料

送檢已死亡巖羊的臟器（心、肝、脾、肺、腎）作為試驗檢測病料。

1.1.2 試劑和設備

試劑：營養瓊脂培養基、血瓊脂培養基、K-B法藥敏紙片（25種）、細菌微量生化鑒定管、0.5麥氏比濁管均購自杭州微生物試劑有限公司；DNA 提取試劑盒、2000DNA Marker、PCR 反應預混酶、50×TAE、瓊脂糖均購自北京全式金公司。

設備：顯微鏡、恒溫培養箱、PCR 擴增儀（Bio-RAD，Mexico）；凝膠成像系統（Bio-RAD，USA）；水浴恒溫振蕩器、DYY-12型電腦三恒多用電泳儀與DYCP-31A型電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.1.3 引物合成

參考Muyzer等[7]方法設計引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成細菌鑒定用通用引物16S rRNA 基因引物，引物序列及大小見表1。

表1 16S rRNA基因PCR擴增引物Tab.1 PCR amplification primers for 16S rRNA gene

1.2 試驗方法

1.2.1 病料觸片鏡檢檢查

將病死巖羊的病料組織心、肝、肺病理變化部位觸片后進行革蘭氏染色。

1.2.2 病原分離培養

將無菌采集死亡巖羊的心臟、肝臟、肺臟等臟器觸片革蘭氏染色鏡檢，并將病料接種于營養肉湯增菌；取24 h的增菌營養肉湯培養物劃線接種于營養瓊脂平板進行純化培養；純化菌落劃線接種于普通營養瓊脂平板、血瓊脂平板，37 ℃、24 h 培養后觀察菌落形態；隨機挑選疑似目標單菌落接種于營養肉湯，培養24 h，涂片革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 生化鑒定

鏈球菌屬生化特性鑒定參考《獸醫微生物》第五版[8]。將血清肉湯24 h 培養物，按照杭州微生物試劑有限公司《鏈球菌屬生化鑒定管說明書》，接種于生化反應管，觀察反應結果。

1.2.4 16S rRNA基因PCR擴增及測序

取純化后營養肉湯培養物，按照細菌DNA 提取試劑盒說明書，提取細菌基因組作為PCR反應模板。

16S rRNA基因PCR擴增：16S rRNA條帶194 bp，PCR擴增體系為50μL：PCR預混酶25μL、上下游引物各1μL、DNA 模板2 μL、雙蒸水21 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個循環；72 ℃、10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

目的條帶的PCR 產物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI數據庫中進行Blast比對分析，并應用MEGA5.1軟件對16S rRNA基因序列進行同源性分析及系統進化樹的構建。

1.2.5 藥敏試驗

藥敏試驗采用Kirby—Bauer 法。挑取單個菌落接種于MH 液體培養基中，37 ℃培養16 h，調整菌液濃度相當于0.5 麥氏單位（1.0×108CFU/mL）。用移液器移取200 μL，用涂菌棒均勻涂布于M-H瓊脂平板上，等培養基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養基表面，于37 ℃培養24 h，游標卡尺測定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準判定分離菌對藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 病死巖羊臨床觀察結果

對1 只已死亡巖羊進行剖檢，可見鼻腔黏膜與眼結膜潮紅并有黏性分泌物；剖檢后可見胃膨大，充滿多量液體和氣體，腸壁血管充血和管壁透明菲薄、十二指腸擴張，腸道漿膜充血、出血、水腫，盲腸氣腫和黏膜充血、出血；肝臟腫大，有小點狀壞死灶，膽囊充盈；肺臟、心臟、腎臟未見異常變化。

2.2 病料鏡檢結果（見圖1、圖2）

由圖1、圖2可知，病料中均可檢出革蘭氏陽性鏈狀球菌，成長鏈或短鏈狀。

圖1 病料心臟革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of diseased heart

圖2 病料肺臟革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of diseased lung

2.3 細菌純化結果

對細菌進行純化培養，在普通營養瓊脂培養基上可見菌落較小、邊緣整齊、呈乳白色、不透明。在血瓊脂平板上培養存在溶血現象。油鏡下進行鏡檢觀察可見革蘭氏陽性鏈狀球菌，成長鏈或短鏈狀。

2.4 生化鑒定結果（見表2）

表2 分離株多動物鏈球菌生化鑒定試驗結果統計表Tab.2 Statistical table of biochemical identification test results of isolated Streptococcus pluranimalium strain

由表2 可知，本次分離菌株S1 發酵棉實糖、海藻糖和山梨醇，而對酶類（賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶）、乳糖和菊糖未發酵。

2.5 分離株細菌16S rRNA基因擴增結果（見圖3）

由圖3可知，凝膠電泳后，所測條帶大小為1500 bp左右，和目的片段大小一致。

圖3 分離株細菌16S rRNA PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of 16S rRNA of isolated bacteria

2.6 16S rRNA基因同源性及系統發育分析結果（見圖4）

圖4 分離株多動物鏈球菌16S rRNA基因同源性及系統發育分析結果Fig.4 Homology and phylogenetic analysis results of 16S rRNA gene ofStreptococcus pluranimalium isolated

由圖4 可知，分離株細菌的16S rRNA 基因序列在線Blast 分析顯示，S116S rRNA 基因序列與GenBank 上已登錄（AccessionNo：NR114042、MN023013、LC316932、MH329623）的多動物鏈球菌的相應序列具有高度同源性≥99.0%。根據16S rRNA 基因序列與上述同源性較高的多動物鏈球菌相應序列建立系統進化樹，分離株與其同源較高的4 株菌形成1 個獨立分支，且（AccessionNo：NR114042、MN023013、LC316932、MH329623）4 株菌處在同一分支，而與分枝AB701574處在不同的分枝，說明同源性不高。

2.7 藥敏試驗結果（見表3）

由表3可知，分離株對青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西環素、四環素、頭孢哌酮、苯唑西林、慶大霉素、環丙沙星、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、紅霉素、多黏菌素B高度敏感；對阿米卡星、復方新諾明、新霉素、呋喃唑酮具有耐藥性。

表3 分離株多動物鏈球菌藥敏試驗結果統計表Tab.3 Results of drug susceptibility test of isolated Streptococcus pluranimalium

3 討論

通過送檢單信息和電話聯系獲知，該巖羊在祁連縣境內，發現時已經死亡，發病巖羊在2 歲齡左右。經試驗分析，根據巖羊死亡時的臨床癥狀和剖檢病理變化，結合培養基和鑒別培養基上的生長形態、顏色、大小等和染色顯微鏡觀察結果，并結合細菌生化試驗和16S rRNA 測序結果，分離得一株多動物鏈球菌S1。

試驗中對分離株細菌S1 進行藥敏試驗，藥敏試驗表明：該分離株細菌對青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西環素、四環素、頭孢哌酮、苯唑西林、慶大霉素、環丙沙星、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、紅霉素、多黏菌素B高度敏感；對阿米卡星、復方新諾明、新霉素、呋喃唑酮具有耐藥性。

我國西北地區自20 世紀60年代以來，就有多起散發的綿羊感染鏈球菌病的病例[9]。但是，據文獻記載，青海省部分地區雖有溶血性鏈球菌的感染[10-11]，但沒有關于野生動物感染多動物鏈球菌的報道[12]。這起野生巖羊多動物鏈球菌感染的病例表明不能忽視細菌性疾病，要防止交叉放牧。可以參考溶血性鏈球菌病的防控辦法，通過注射多價菌苗預防，從而消除傳染源,減少疫病發生[13-14]。發病后要對病畜進行及時隔離治療，圈舍及時用3%的來蘇水消毒液進行徹底消毒處理。帶菌母畜要果斷淘汰,對病死畜禽進行無害化處理。治療方面，參考除西醫按照藥物敏感性實驗用運抗生素外，還可在飼料中添加50 g大青葉、20 g雙花、30 g 連翹、30 g 蒲公英、30 g 蒼術（為細末），1%拌料飼喂[15]。另外，對于多種家畜能感染本病的特點出發，防控應遵從預防為主，防治結合的原則，圈舍要注意適時通風降溫，搞好衛生消毒，增加飼料的營養價值，從提升動物機體本身的抵抗力方面加大對于本病的防控。

4 結論

本試驗研究發現，青海省野生動物中存在多動物鏈球菌的感染；該菌對該分離株細菌對青霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、呋喃唑酮、多西環素、四環素、頭孢哌酮、苯唑西林、慶大霉素、環丙沙星、頭孢拉定、頭孢他啶、哌拉西林、紅霉素、多黏菌素B 高度敏感；對阿米卡星、復方新諾明、新霉素、呋喃唑酮具有耐藥性。