基于Co3O4納米粒子的“串聯酶”活性檢測葡萄糖的表面增強拉曼光譜策略

夏學敏 張 霞 翁儀瑾 張 壘 唐如意

(上海工程技術大學材料工程學院，上海 201620)

0 引 言

表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)以其超高的靈敏度和無損檢測的特點，已經在表面科學、分析化學和生物化學等領域得到廣泛的應用[1-4]。傳統的SERS基底仍然是金、銀、銅等貴重金屬材料，然而其制作成本高、過程復雜且重復性差，所以出現了一些特殊制備的金屬納米材料，也可以作為拉曼基底，例如，Fe3O4納米顆粒[5-6]、MnO2納米薄片[7]和 SiO2納米粒子[8]等。

目前，葡萄糖的檢測方法有很多，例如熒光法[9]、分光光度法[10]、層析法[11]、電分析法[12]等。張玲玲課題組[13]發現TiO2納米管陣列具有過氧化物酶活性，偶聯葡萄糖氧化酶(GOx)可以測定葡萄糖，線性范圍為4×10-4～3.6×10-3mol·L-1。王炎課題組[14]制備出具有過氧化物酶活性的二維(2D)Ni基金屬-有機骨架(MOF)納米片，得到了檢測人體血清中葡萄糖的納米傳感器。但上述方法存在制備方法復雜、靈敏度不高、檢測極限有限等缺點，拉曼光譜法具有檢測時間短、靈敏度高、檢測限低等優點。經拉曼光譜法得到的信號峰尖銳、特征明顯且樣品制備過程簡單，并且可以在30 s內，較低濃度下獲得每個樣品顯著的SERS信號。

隨著納米技術的發展，納米酶(也稱類酶納米材料)由于制備過程更容易、成本更低、穩定性更強、催化活性更高，實現了在分析化學、催化和癌癥治療等領域的廣泛應用，成為了天然酶的替代品。然而，已報道的納米酶通常局限于有限種類的酶活性，如類過氧化物酶[15-17]和類超氧化物歧化酶活性[18-20]等。同時具有類過氧化物酶和類葡萄糖氧化酶活性的“串聯酶”最早被韓磊的課題組[21]提出，他們將“非裸”的Au NPs定義為“串聯酶”。

基于以上原因，我們制備了一種金屬氧化物納米粒子作為拉曼基底實現葡萄糖的微量檢測。通過簡單的濕化學法合成了Co3O4納米顆粒(NPs)，驗證了其類過氧化物酶活性和“串聯酶”活性并進行“串聯酶”的優化，通過調節反應條件使其達到最佳活性，最后通過拉曼散射光譜分析了葡萄糖的含量。單一Co3O4納米酶極大地促進了催化過程和產物的生成。

1 實驗部分

1.1 試劑

六水氯化鈷(CoCl2·6H2O)、硼氫化鈉(NaBH4)購自中國上海國藥控股化學試劑有限公司。牛血清蛋白(BSA)購自Salarbio(北京)。3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)、過氧化氫(H2O2，30%)、甘氨酸-HCl緩沖液(pH=2.0～3.0)、醋酸鈉緩沖液(pH=4.0～5.0)和磷酸鹽緩沖液(pH=6.0～7.0)均取自上海阿拉丁生化科技有限公司。所有化學品均未經進一步凈化而直接使用。

1.2 儀器

采用掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S4800)對樣品的形貌尺寸進行表征，其主要技術參數：二次電子成像分辨率為1.0 nm@15 kV、加速電壓0.1～30 kV。采用X射線衍射(XRD，Rigaku Ultima Ⅳ)對樣品的物相結構進行表征，其主要技術參數：工作電壓40 kV、輻射源CuKα靶、波長0.154 nm、掃描范圍20°～80°。采用 X 射線光電子能譜(XPS，Thermo Scientific K-Alpha)對樣品的物質成分進行表征，其主要技術參數：離子槍能量范圍100～4 000 eV、180°雙聚集半球分析。采用HORIBA集團生產的拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution)對樣品進行SERS分析，其主要技術參數：全波長范圍200～2 000 nm、波數范圍50～9 000 cm-1、光譜分辨率 1 cm-1，激發光波長為633 nm。

1.3 Co3O4 NPs的合成

采用濕化學法制備了Co3O4NPs。首先，800 μg BSA 與 1 mL CoCl2·6H2O 水溶液(5×10-3mol·L-1)在25 ℃下培養1 h。然后，將1 mL NaBH4(1×10-2mol·L-1)添加到上述混合溶液。在NaBH4還原Co2+的作用下，以BSA為穩定劑形成灰色Co，新生成的Co在空氣中自發氧化為穩定的黑色Co3O4[22-23]。放置12 h后，離心，收集BSA模板化的Co3O4NPs，用水洗凈，4℃保存。取一定量Co3O4NPs固體顆粒配成濃度為20 mg·L-1的水溶液備用。

1.4 類過氧化物酶活性的測定

Co3O4NPs的類過氧化物酶活性按以下步驟進行：首先，取4個小試管依次加入5 μL Co3O4NPs、10 μL H2O2(30%)、10 μL TMB 和 30 μL NaAc 緩沖液(pH=4.0)；10 μL TMB、10 μL H2O2和 30 μL NaAc 緩沖液；5 μL Co3O4NPs、10 μL H2O2和 30 μL NaAc緩沖液；30 μL NaAc緩沖液。上述4種混合溶液在充分反應后，離心，上清液被快速轉移到毛細管中，通過SERS進行測量。其次，在含有10 μL TMB的30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)中，加入一系列不同濃度(1～10-9mol·L-1)的 H2O2溶液、5 μL Co3O4NPs和 10 μL TMB，轉移到毛細管中后，仍然通過SERS進行測量。采用不同pH值(2.0～7.0)的緩沖溶液研究pH對Co3O4NPs催化活性的影響。在10～80℃之間研究溫度對類過氧化物酶活性的影響。

1.5 “串聯酶”活性的測定

在小試管中先加入30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)，再加入 10 μL TMB、10 μL 不同濃度(10-2～10-10mol·L-1)的葡萄糖溶液和 5 μL Co3O4NPs。讓上述混合物在常溫(25℃)下充分反應，離心，然后將上清液快速轉移到毛細管中，通過SERS進行測量。采用不同pH值(2.0～7.0)的緩沖溶液研究pH對Co3O4NPs催化活性的影響。在10～80℃之間研究溫度對“串聯酶”活性的影響。

1.6 葡萄糖的檢測

對于葡萄糖的定量分析，在小試管中先加入30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)，再加入10 μL TMB、10 μL不同濃度(10-2～10-10mol·L-1)的葡萄糖溶液和 5 μL Co3O4NPs。讓上述混合物在常溫(25℃)下充分反應，離心，然后將上清液快速轉移到毛細管中，通過SERS進行測量。然后通過線性擬合繪制校準曲線。另外驗證了其他糖對葡萄糖檢測的干擾：準備5個小試管，先加入30 μL NaAc緩沖液(pH=4.0)，再分別加入10 μL濃度為10-2mol·L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖、麥芽糖和 10 μL TMB、5 μL Co3O4NPs，通過SERS進行測量。

2 結果與討論

2.1 Co3O4 NPs的表征

通過SEM觀察Co3O4NPs的形態(圖1a、1b)。如圖1所示，所制備的Co3O4NPs接近塊狀并且高度分散。為了進一步研究Co3O4NPs的化學組成，通過EDS光譜檢測Co3O4NPs。圖1c顯示該材料由Co、O兩種元素組成。圖1d為Co3O4NPs的XRD圖，由圖可知，除了在24°歸屬于基底碳布的較強峰外，各衍射峰的位置與 Co3O4立方晶系的(111)、(220)、(311)、(400)、(511)、(440)晶面相對應，與 Co3O4的標準圖(PDF No.42-1467)相吻合，圖中少量雜峰的出現說明合成的材料純度較高。利用XPS表征了Co3O4納米顆粒的表面組成，圖1e的全譜圖也表明Co、O元素的存在，圖1f、1g分別為O1s和Co2p的高分辨XPS譜圖，其中Co2p譜圖中的2個主峰794.9和779.8 eV分別對應Co3O4的Co2p1/2和Co2p3/2自旋軌道峰[24]。以上結果說明Co3O4NPs被成功制備。

圖1 Co3O4 NPs的SEM圖 (a、b)、EDS譜圖 (c)、XRD圖 (d)和XPS譜圖 (e～g)Fig.1 SEM images(a,b),EDS spectrum(c),XRD pattern(d)and XPS spectra(e～g)of Co3O4 NPs

2.2 Co3O4 NPs的類過氧化物酶活性

為了驗證Co3O4NPs的類過氧化物酶活性，我們構建了一個NPs-H2O2-TMB反應體系，該體系以H2O2、NaAc緩沖液和TMB為底物進行催化反應。在H2O2存在的條件下，Co3O4NPs能夠催化TMB氧化生成藍色產物氧化TMB(oxTMB)。如圖2a所示，僅NPs-H2O2-TMB反應體系的溶液顏色變成藍色，而對照組未發生顏色反應，說明僅在NPs-H2O2-TMB反應體系中才能產生大量的oxTMB，使得溶液變色。圖2b中在1 188、1 330和1 610 cm-1處均檢測到明顯的SERS信號，這是由oxTMB引起的。其中，SERS信號中1 188 cm-1處拉曼峰對應于CH3的彎曲振動峰，1 330 cm-1處拉曼峰對應于苯環內的C—C伸縮振動峰，1 610 cm-1處拉曼峰對應于苯環的伸縮縫和C—H伸縮振動峰[25]。因此，這3個拉曼峰均可用于NPs-H2O2-TMB反應體系的分析。通過4種不同反應體系的SERS光譜可知，曲線Ⅰ和Ⅱ上有較強的拉曼峰，曲線Ⅲ和Ⅳ上有微弱的峰或無峰，說明真正參與反應的是TMB和H2O2；曲線Ⅰ上oxTMB的拉曼峰比曲線Ⅱ的強，說明是Co3O4NPs起催化作用；曲線Ⅲ上有微弱的拉曼峰，說明TMB在空氣中有一部分發生自然氧化；曲線Ⅳ上無拉曼峰，說明NaAc起的是緩沖液的作用。因此在反應體系中的催化反應是由TMB、H2O2和Co3O4NPs的共催化作用引起。綜上證明了Co3O4NPs具有類過氧化物酶活性。

圖2 (a)不同反應體系的顏色照片和(b)不同反應體系的SERS光譜Fig.2 (a)Visual photograph and(b)SERS spectra of different reaction systems

在NPs-H2O2-TMB反應體系引入一系列濃度梯度(1～10-9mol·L-1)的H2O2溶液。如圖3所示，H2O2的濃度越高，oxTMB的3個特征峰的SERS信號越強。當H2O2濃度低至10-9mol·L-1時仍然有明顯的SERS信號，這表明了Co3O4NPs具有良好的類過氧化物酶活性。目前，基于這一反應體系的檢測方法有很多，例如紫外分光光度法[26]，但待檢測物在較低濃度(1×10-6mol·L-1)下沒有明顯的吸收峰，而拉曼光譜法具有更高的靈敏度以及檢測限低的優點。

2.3 Co3O4 NPs的“串聯酶”活性

為了驗證Co3O4NPs的“串聯酶”活性，我們構建了一個NPs-葡萄糖-TMB的反應體系，該體系是由Co3O4NPs、葡萄糖、NaAc緩沖液和TMB組成。整個反應過程包括2個步驟：

首先，Co3O4NPs催化葡萄糖與空氣中的O2生成葡萄糖酸和H2O2，如式(1)所示：

其次，Co3O4NPs催化H2O2和TMB生成H2O和oxTMB，如式(2)所示。

我們研究發現Co3O4NPs在第一步中表現出類葡萄糖氧化酶的活性，在第二步中表現出類過氧化物酶的活性，且在第一步中產生的H2O2可以引發第二步的類過氧化物酶活性的催化反應。與以往的葡萄糖分析方法相比，這個反應體系不添加H2O2就可以促進檢測過程。如圖4所示，在不存在H2O2的反應體系中，仍然可以在1 188、1 330和1 610 cm-1處檢測到oxTMB的SERS信號。在Co3O4NPs催化作用下，由于葡萄糖濃度的增加，可以生成大量的H2O2進而促進TMB的氧化，所以oxTMB的3個特征峰的強度逐漸增大，由此可以證明Co3O4NPs具有“串聯酶”活性，而且當葡萄糖濃度低至10-10mol·L-1時也存在明顯的SERS信號，這表明了Co3O4NPs具有良好的“串聯酶”活性[21]。

圖4 在NPs-葡萄糖-TMB體系中不同濃度的葡萄糖對oxTMB的SERS光譜的影響Fig.4 Effect of different concentrations of glucose on the SERS spectra of oxTMB in NPs-glucose-TMB system

2.4 納米酶活性的優化

眾所周知，納米酶已經逐漸成為替代天然酶的熱門材料。但納米酶的活性仍然受pH和溫度的影響。因此，為了進一步優化Co3O4NPs的類過氧化物酶和“串聯酶”活性，我們分別研究了實驗條件變化對Co3O4NPs“串聯酶”活性的影響。首先，優化實驗中的pH。圖5a是不同pH值(2.0～7.0)下NPs-H2O2-TMB體系的SERS信號強度，圖中最高點對應最佳pH值時的拉曼強度，其對應樣品的相對活性為100%。通過對比發現，隨著pH值的增加，SERS強度在pH=2.0～4.0的范圍內增加，然后在pH=4.0～7.0的范圍內降低。值得注意的是，對于類過氧化物酶活性，基于NPs-H2O2-TMB體系的Co3O4NPs在pH=4.0的條件下顯示出最高的類過氧化物酶活性(圖5b)，但在pH=3.8～4.5時仍保持90%的活性。而對于“串聯酶”活性，在pH=4.0的NaAc緩沖液中，基于NPs-葡萄糖-TMB體系，pH=4.0時Co3O4NPs顯示出最高的“串聯酶”活性。綜上可知，Co3O4NPs的類過氧化物酶和“串聯酶”活性的最佳pH值一致。

圖5 納米酶活性的pH優化:NPs-H2O2-TMB體系中(a)不同pH值下類過氧化物酶活性的SERS光譜和(b)Co3O4 NPs在不同pH值下類過氧化物酶活性的相對強度;NPs-葡萄糖-TMB體系中(c)不同pH值下“串聯酶”活性的SERS光譜和(d)Co3O4 NPs在不同pH值下“串聯酶”活性的相對強度Fig.5 pH optimization of nano-enzyme activity:(a)SERS spectra of peroxidase-like activity at different pH values and(b)relative strength of peroxidase-like activity of Co3O4 NPs at different pH values in NPs-H2O2-TMB system;(c)SERS spectra of“tandem enzyme”activity at different pH values and(d)relative strength of“tandem enzyme”activity at different pH values in the NPs-glucose-TMB system

其次，研究了不同溫度(10～80℃)下Co3O4NPs的活性。對于類過氧化物酶活性，基于NPs-H2O2-TMB體系，當溫度為60℃時顯示出最高的類過氧化物酶活性(圖6a、6b)。對于“串聯酶”活性，基于NPs-葡萄糖-TMB體系，在pH=4.0的NaAc緩沖液中，當溫度為60℃時顯示出最高的“串聯酶”活性(圖6c、6d)。類過氧化物酶和“串聯酶”活性在10～60℃的溫度范圍內升高，而在60℃以上時降低。與類過氧化物酶活性不同的是，“串聯酶”在50～65℃范圍內可以保持80%的活性。根據以上結果可知，Co3O4NPs的類過氧化物酶和“串聯酶”活性的最佳溫度一致。

圖6 納米酶活性的溫度優化:NPs-H2O2-TMB體系中(a)在不同溫度下類過氧化物酶活性的SERS光譜和(b)不同溫度下Co3O4 NPs類過氧化物酶活性的相對強度;NPs-葡萄糖-TMB體系中(c)在不同溫度下“串聯酶”活性的SERS光譜和(d)不同溫度下Co3O4 NPs“串聯酶”活性的相對強度Fig.6 Temperature optimization of nano-enzyme activity:(a)SERS spectra of peroxidase-like activity at different temperatures and(b)relative strength of peroxidase-like activity of Co3O4 NPs at different temperatures in NPs-H2O2-TMB system;(c)SERS spectra of“tandem enzyme”activity at different temperatures and(d)relative intensity of“tandem enzyme”activity at different temperatures in the NPs-glucose-TMB system

2.5 葡萄糖的檢測

基于Co3O4NPs的“串聯酶”活性，我們提出了一種新的應用于葡萄糖檢測的SERS策略。在NPs-葡萄糖-TMB的體系中進行Co3O4NPs與不同濃度葡萄糖的催化反應。插圖為NPs-葡萄糖-TMB的體系中含有不同濃度(10-2～10-10mol·L-1)葡萄糖的溶液，可以明顯地觀察到反應溶液的顏色呈現從深到淺的規則變化。將圖7a中的3條線進行線性擬合得到圖7b～7d，對比發現圖7b中1 610 cm-1的SERS強度與葡萄糖濃度具有最佳的線性關系，其回歸方程為y=398.28x+3 969(R2=0.990 4)，線性范圍為 10-10～10-2mol·L-1，檢測限(LOD)為 10-10mol·L-1。由此，證明了該方法的可行性。此外，基于Co3O4納米顆粒“串聯酶”活性檢測葡萄糖的SERS策略所用的響應時間為30 s，而已報道的基于金納米顆粒的無酶分析方法[25]的響應時間要在7 h以上，顯然，我們的檢測方法所用的響應時間更短，這表明Co3O4NPs有成為一種新的葡萄糖傳感器的巨大潛力。

圖7 (a)oxTMB的SERS強度隨葡萄糖濃度變化折線圖,插圖顯示了葡萄糖濃度從高到低時的反應產物oxTMB的視覺效果圖;(b)1 610 cm-1的特征峰處葡萄糖檢測的校正曲線;(c)1 330 cm-1的特征峰處葡萄糖檢測的校正曲線;(d)1 188 cm-1的特征峰處葡萄糖檢測的校正曲線Fig.7 (a)Broken line graph of SERS intensity of oxTMB changing with glucose concentrations,the inset shows a visual rendering of the reaction product oxTMB changing with glucose concentrations from high to low;(b)Calibration curve for glucose detection at 1 610 cm-1;(c)Calibration curve for glucose detection at 1 330 cm-1;(d)Calibration curve for glucose detection at 1 188 cm-1

另外，我們驗證了其他糖對葡萄糖的干擾。如圖8所示，與存在葡萄糖的反應體系中的SERS信號強度相比，存在蔗糖、半乳糖、木糖或麥芽糖的反應體系中的SERS信號強度較小，說明此方法具有良好的選擇性。

圖8 相同濃度葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖、麥芽糖在不同反應體系中oxTMB的SERS光譜Fig.8 SERS spectra of oxTMB in the different reaction systems with the same concentration of glucose,sucrose,galactose,xylose and maltose

3 結 論

綜上所述，我們利用BSA作為生物模板，采用濕化學法合成了Co3O4NPs。制備的Co3O4NPs既具有類過氧化物酶活性，又具有“串聯酶”活性(類過氧化物酶和類葡萄糖氧化酶活性)。而且在相同的pH和溫度范圍內，Co3O4NPs顯示出最佳的串聯酶活性。在此基礎上，利用Co3O4NPs的“串聯酶”活性，結合SERS光譜，提出了一種檢測葡萄糖的新策略。這一方法具有靈敏度高、檢測極限低、準確度高和對真實樣品分析的可靠性好等特點，不僅為BSA定向合成金屬納米材料(Co3O4NPs)提供了新的途徑，更拓寬了納米酶的種類，而且還可以促進納米酶與抗原、抗體、熒光探針等分子的功能化，在免疫檢測、生物傳感器、醫療等領域具有廣闊的應用前景。