3-(2-吡啶-3-乙烯基)-1H-吲哚釕配合物的合成及抗腫瘤性能

錢曉婷 呂夢迪 王 裙 陶 欽 薛旭玲 劉紅科

(南京師范大學化學與材料科學學院，南京 210023)

癌癥作為全球人類死亡的第二大殺手，給人們的生命健康帶來了極大的威脅。作為臨床常用的金屬化療藥物，鉑類藥物具有較好的藥理學特性，對多種實體瘤都具有很好的治療效果[1-2]，但是這類金屬藥物的腎毒性及耐藥性等問題極大地限制了其藥效發揮[3-4]。因此，科學家們逐漸把目標轉向其他類金屬(如釕、銥、鋨及銠等)抗癌配合物[5-8]，這類抗癌配合物與鉑類藥物相比具有低毒性、無耐藥性及豐富的光學性質等優良特性。Keppler等報道的KP1019是進入Ⅰ期試驗的釕類配合物，研究表明該配合物具有較好的穩定性，且對順鉑耐藥的腫瘤細胞也表現出良好的細胞毒性[9]。Sadler課題組報道了一系列具有生物活性的釕類配合物，發現這些釕類配合物具有較小的毒副作用、高的細胞攝取量及生物靶點豐富等優良特性，表現出巨大的應用前景[10-12]。本課題組也通過將金屬釕與天然產物甘草次酸、紫蘇醇及大黃酸等相連接，設計得到了一系列具有良好抗腫瘤活性的釕配合物[13-14,17]。其中聯吡啶釕類配合物因其大的斯托克斯位移、較長的發光壽命、很高的反應活性以及氧化還原等特性，使其成為潛在的診療一體化的藥物應用于生物體內[15-17]。一些聯吡啶釕類藥物還可以做到可控藥物釋放和不同光激發下的實時監測，實現了實時定量監測藥物輸送過程[18-19]。

吲哚類化合物在自然界中廣泛存在，是具有苯并五元氮雜環結構單元的一大類化合物。該類化合物是一類重要的雜環衍生物生物堿，在生物體內顯現出了良好的抗腫瘤活性[20-23]。靛玉紅、長春堿等吲哚類化合物對慢粒白血病、絨毛膜上皮癌、乳腺癌及宮頸癌等都具有較好的療效，因而受到廣泛關注[24-26]。Sugen公司于2006年上市的舒尼替尼是一種多靶點抑制劑，主要用于治療惡性間質瘤[27]。這類小分子均通過抑制微管蛋白的合成來影響有絲分裂過程，從而達到抗腫瘤的目的[28-29]。同時還有一些吲哚類的小分子具有抑制腫瘤細胞中2，3-雙加氧酶生成的作用，2，3-雙加氧酶的過量表達會導致色氨酸的代謝或不足，而導致T細胞的無效性，抑制其生成可以達到免疫治療的功效[30]。因此，吲哚類小分子化合物在抗癌領域具有廣泛的應用前景，值得進一步探究。

在本工作中，我們合成了一種基于吲哚類衍生物的二聯吡啶釕配合物，并對其進行了核磁及質譜的表征。使用MTT法對配合物的細胞毒活性進行了評估，通過共聚焦成像、電感耦合等離子體質譜確定了配合物的亞細胞器定位，同時使用流式細胞術及免疫蛋白印跡等手段對配合物誘導腫瘤細胞死亡的方式等進行了深入研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗所用的試劑及化學藥品均為商用分析純，無需進一步純化即可直接使用。水合氯化釕(RuCl3·3H2O)、3-吡啶乙酸鹽酸鹽 (3-pyridylacetic acid hydrochloride)、1H-吲哚-3-甲醛(1H-indole-3-carbaldehyde)、2，2′-聯吡啶(2，2′-bipyridine)、氯化鋰(lithium chloride)等化學藥品購于晚晴化學品公司。六氫吡啶、二甲基亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等試劑均購于阿拉丁試劑有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、Dulbecco改良的細胞培養基(DMEM)、鏈霉素和青霉素、胰蛋白消化酶-EDTA、細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、細胞自噬檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒等生物試劑均購于南京凱基生物科技有限公司。

1H NMR使用Bruker Avance Ⅱ 400 MHz波譜儀檢測；電噴霧電離質譜(ESI-MS)使用LCQ(Thermo Scientific)質譜儀檢測；UV-Vis數據使用Lambda 365紫外可見分光光度計測得；熒光數據使用FS5熒光分光光度計(Edinburgh Instrument)獲得；化合物的細胞毒活性通過多功能酶標儀LabServ K3測定；激光共聚集顯微鏡(A1，Nikon)測試配合物在細胞內的共定位成像；應用流式細胞儀(BD FACSverse，美國)進行細胞凋亡、周期及自噬等分析測定；采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，X Series 2，Thermo Fisher)測定金屬元素Ru在細胞器內的含量；在Mini-Protean Tetra System(BIO RAD，Power PacTM HC)上進行蛋白免疫印跡(Western Blot)實驗。

1.2 配體及配合物的合成

1.2.1 3-(2-吡啶-3-乙烯基)-1H-吲哚配體Indole的合成

將 3-吡啶乙酸鹽酸鹽(0.52 g，3 mmol)溶解在1，4-二氧六環(6 mL)中，并加入三乙胺(1 070 μL，7.6 mmol)，將混合溶液在環境溫度下避光攪拌20 min，隨后加入 1H-吲哚-3-甲醛(0.292 g，2.0 mmol)和六氫吡啶(440 μL)，并將上述混合液在氬氣氣氛下避光室溫攪拌20 h，使用薄層色譜法(TLC)監測至反應結束后旋干溶劑。將所得粗產物通過快速柱色譜法(石油醚/乙酸乙酯，4∶1，V/V)分離提純，得到淺黃色固體(0.308 g，70%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ11.40(s，1H)，8.76(d，J=2.0 Hz，1H)，8.37(dd，J=4.7，1.5 Hz，1H)，8.02(ddd，J=8.0，7.1，4.7 Hz，2H)，7.69(d，J=2.6 Hz,1H),7.58(s,1H)，7.54(s,1H)，7.43(t，J=9.2 Hz，1H)，7.36(dd，J=7.9，4.7 Hz，1H)，7.25～7.04(m，3H)。ESI-MS(m/z)：[Indole+H]+理論值：220.28，實驗值：220.15。元素分析按 C15H12N2計算值(%)：C 81.79，H 5.49，N 12.72。實驗值(%)：C 81.87，H 5.51，N 12.65。

1.2.2 二聯吡啶釕前體Ru(bpy)2Cl2的合成

將 RuCl3·3H2O(3.6 g，14.9 mmol)、2，2′-聯吡啶(4.68 g，30 mmol)、LiCl(4.2 g，1 mmol)和 DMF(25 mL)加入到避光的三口燒瓶中，將混合物在氬氣氛圍下加熱回流攪拌10 h，TCL監測至反應結束后旋干溶劑。待冷卻至室溫后，將反應液倒入丙酮(125 mL)中，在0℃下冷卻過夜。過濾該混合物，分別用水(15 mL×3)、乙醇(15 mL×3)和乙醚(15 mL×3)依次洗滌固體，然后將固體放入真空烘箱中干燥過夜，得到棕黑色粉末即為純的產品(4.7 g，78%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ9.97(d，J=4.7 Hz，1H)，8.65(d，J=8.0 Hz，1H)，8.50(d，J=8.0 Hz，1H)，8.14～8.02(m，1H)，7.78(dd，J=9.6，3.6 Hz，1H)，7.73～7.64(m，1H)，7.52(d，J=5.5 Hz，1H)，7.19～7.04(m，1H)。ESI-MS(m/z)：[Ru(bpy)2]2+理論值：206.67，實驗值：206.58。

1.2.3 配合物Ru-Indole的合成

將前體 Ru(bpy)2Cl2(96 mg，0.18 mmol)、配 體Indole(44 mg，0.2 mmol)、10 mL乙醇-水的混合溶劑(8∶2，V/V)加入到三口燒瓶中，并將混合物在氬氣氛圍下回流24 h，TLC監測至反應結束后旋干溶劑。加入三氯甲烷(2 mL)溶解固體，再加入乙醚(15 mL)將配合物沉淀出來，將混合物在0℃冷卻過夜。離心得到固體后，用乙醚(10 mL×2)和丙酮(10 mL×2)洗滌，真空干燥過夜，得到95.1 mg較純的深紅色固體，即為產品Ru-Indole，產率約為75%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ11.50(s，1H)，9.91(t，J=22.0 Hz，1H)，8.79(t，J=11.1 Hz，1H)，8.71～8.64(m，1H)，8.60(dd，J=10.0，7.2 Hz，1H)，8.25～8.12(m，1H)，8.06(d，J=8.0 Hz，1H)，7.93(dd，J=9.1，5.2 Hz，2H)，7.81～7.74(m，1H)，7.71(s，1H)，7.63(d，J=5.3 Hz，1H)，7.42(dd，J=15.6，7.2 Hz，1H)，7.30(dd，J=12.9，6.7 Hz，1H)，7.16(dt，J=15.0，6.7 Hz，1H)，6.92(d，J=16.6 Hz，1H)。ESIMS(m/z)：[Ru-Indole-Cl]+理論值：669.17，實驗值：669.11。元素分析按C35H28ClF6N6PRu計算值(%)：C 51.64，H 3.47，N 10.32。實驗值(%)：C 51.73，H 3.55，N 10.27。

1.3 配體及配合物的光物理性質測定

使用紫外可見分光光度計檢測了配體Indole及配合物Ru-Indole在298 K下的紫外吸收光譜。用DMSO將配合物及配體溶解并制成20 mmol·L-1的儲存液，用水將兩者的儲存液分別稀釋成30 μmol·L-1的含有1% DMSO的樣品溶液。測試時石英比色皿與光源路徑為1 cm，吸收波長收集范圍設定為250～600 nm。使用熒光分光光度計檢測配合物及配體在298 K下的熒光發射光譜。用水將兩者的儲存液分別稀釋成10 μmol·L-1的含有1% DMSO的樣品溶液，并在488 nm激發波長下使用熒光分光光度計記錄下550～700 nm范圍內的發射光譜。

1.4 配體及配合物的脂水分配系數

使用搖瓶法測試Indole、Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole的脂水分配系數。使用正辛醇與0.9% NaCl溶液等體積搖動48 h使水相與有機相互飽和。將三者分別溶解在分離出的NaCl溶液中，再加入等體積的分離出的正辛醇溶液，在室溫下搖動2 h，使樣品在兩相中達到分配平衡。用7 000 r·min-1的轉速將樣品離心5 min，分別吸出有機相及水相，使用紫外可見分光光度計測試兩相中的吸光度，通過在有機相及水相中的吸光度的比值求對數計算出脂水分配系數lgPo/w值。

1.5 體外細胞毒活性檢測

選用人源腫瘤細胞系宮頸癌細胞(HeLa)、人非小細胞肺癌細胞(A549)、乳腺癌細胞(MCF-7)、肝癌細胞(HepG2)及人正常肝細胞(LO2)，對配體Indole、配合物前體Ru(bpy)2Cl2、配合物Ru-Indole以及對照藥物順鉑(cisplatin)采用 MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)法[31]進行細胞毒活性測定。細胞在含有10% FBS(胎牛血清，Gibco BRL)、100 μg·mL-1鏈霉素和100 μg·mL-1青霉素(Gibco BRL)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基，Gibco BRL)中培養。在96孔細胞培養板中接種(每孔5 000個)對數生長期的細胞，將細胞在5%(體積分數,下同)的CO2、310 K條件下培養過夜以確保細胞貼壁且正常生長,加入不同濃度的待測藥物(培養基中含1%的DMSO溶液)繼續孵育48 h。然后每孔加入20 μL的濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續于培養箱中孵育4 h。吸出培養液，在每個孔中加入150 μL的二甲亞砜溶液，振蕩5 min后，使用LabServ K3酶標儀讀取590 nm處吸光度值，計算各物質對癌細胞在48 h內增殖的半數抑制濃度(IC50值)[32]。

1.6 配合物的亞細胞器分布

激光共聚焦成像實驗：分別使用探針Mito-green、Lyso-blue、Hoechst 33342檢測Ru-Indole在HeLa細胞中線粒體、溶酶體和細胞核中的分布。將HeLa細胞以5×105mL-1的密度接種于12孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細胞貼壁生長。然后向其中加入含20 μmol·L-1待測藥物的DMEM培養基(含有1% DMSO)溶液，繼續孵育12 h。吸出培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將濃度為2 μmol·L-1的線粒體、溶酶體及細胞核染料分別加入對應的孔中，孵育30 min后吸出染料，并用PBS洗滌3次，取出蓋玻片并倒扣在載玻片上，在共聚焦顯微鏡下進行測試。商業染料為Mito-green(λex=490 nm，λem=516 nm)、Lyso-blue(λex=373 nm，λem=425 nm)、Hoechst 33342(λex=346 nm，λem=460 nm)。

電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)：將HeLa細胞以2×106mL-1的密度接種在10 cm細胞培養皿中，并將細胞在5% CO2、310 K條件下孵育12 h。然后將含20 μmol·L-1Ru-Indole的DMEM培養基(含有1% DMSO)溶液添加到細胞中，繼續孵育12 h，收集細胞并用PBS洗滌2次。然后用線粒體/細胞核制備試劑分別提取細胞核、線粒體和細胞質。分別向提取到的細胞核、線粒體和細胞質中依次添加濃硝酸(100 μL，95 ℃，2 h)、30%過氧化氫(50 μL，95 ℃，1.5 h)和濃鹽酸(50 μL，95 ℃，0.5 h)，將細胞器完全消解。待溶液冷卻至室溫后，將消化得到的液體過濾并用超純水稀釋至2 mL。樣品中釕元素的含量通過ICPMS(X系列2，Thermo Fisher，美國)測定。每個樣品測試3次，將平均值作為最終結果。

1.7 細胞周期阻滯檢測

使用細胞周期檢測試劑盒(RNase A/PI)研究Ru-Indole對HeLa細胞周期的影響。將HeLa細胞以1.5×106mL-1的密度接種于6孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細胞貼壁生長。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的配合物的DMEM培養基(含有1% DMSO)溶液，繼續孵育24 h。收集細胞，用PBS洗滌2次，緩慢加入體積分數為70%的冰乙醇來重懸細胞，并置于4℃的冰箱中過夜固定。離心除去固定液收集細胞，用PBS洗滌2次，然后將根據一定比例(PI/RNase A，9∶1，V/V)配制的染色液加入到細胞中并在黑暗條件下孵育30 min。在30 min內使用BD FACSverse流式細胞儀分析樣品，選擇的通道為FL2(λex=488 nm，λem=620 nm)，使用FlowJo10.1軟件分析實驗結果。

1.8 細胞凋亡檢測

使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒探究Ru-Indole誘導HeLa細胞的死亡方式。將HeLa細胞以1.5×106mL-1的密度接種于6孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細胞貼壁生長。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的Ru-Indole的DMEM培養基(含有 1% DMSO)溶液繼續孵育24 h。收集細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，并用500 μL的Binding buffer重懸細胞。每個孔中分別加入5 μL的V-FITC和5 μL的PI對細胞進20 min的避光染色處理，0.5 h內使用BD FACSverse流式細胞儀對樣品進行檢測。PI的激發波長：488 nm，發射波長：550～610 nm；FITC的激發波長：488 nm，發射波長：500～560 nm。

1.9 線粒體膜電位(MMP)的檢測

使用線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1檢測Ru-Indole處理的HeLa細胞MMP的變化。將HeLa細胞以1.5×106mL-1的密度接種于6孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細胞貼壁生長。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的配合物的 DMEM 培養基 (含有 1% DMSO)溶液繼續孵育24 h。收集細胞，用PBS洗滌2次，并添加到配制的JC-1工作溶液中染色25 min。離心收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，之后將細胞重懸于PBS緩沖液中。0.5 h內使用BD FACSverse流式細胞儀分析樣品，選擇的通道為FL1(λex=488 nm，λem=510～550 nm)和 FL2(λex=525 nm，λem=560～620 nm)，最后使用FlowJo10.1軟件進行實驗結果分析。

1.10 細胞自噬分析

激光共聚焦成像實驗：使用細胞自噬檢測試劑盒對配合物Ru-Indole誘導細胞產生自噬的細胞群進行熒光成像分析。將HeLa細胞以5×105mL-1的密度接種于12孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細胞貼壁生長。然后向其中加入含20 μmol·L-1待測藥物的 DMEM 培養基(含有 1% DMSO)溶液，繼續孵育24 h。用PBS緩沖液洗滌細胞2次，加入3.7%甲醛固定，并在室溫下孵育20 min，除去溶液，用PBS洗滌2次后向12孔板中加入0.2% Triton X-100滲透液共孵育15 min后去除，加入一抗LC3兔多抗工作液，在黑暗條件下室溫孵育2 h，然后用PBS緩沖液洗滌細胞3次。再加入FITC標記的山羊兔抗IgG的二抗在黑暗中繼續孵育1 h，用PBS洗滌細胞3次。然后加入DAPI工作液孵育3～5 min來染色細胞核，用PBS洗滌細胞2次，立即使用共聚焦顯微鏡進行拍攝。DAPI的激發波長：357 nm，發射波長：430～490 nm；FITC的激發波長：488 nm，發射波長：500～560 nm。

蛋白免疫印跡實驗：將HeLa細胞以2×106m L-1的密度接種于10 cm培養皿中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細胞貼壁生長。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的Ru-Indole的DMEM培養基(含有1% DMSO)溶液繼續孵育24 h。之后，通過離心收集全細胞，使用RIPA細胞裂解試劑盒在0℃條件下提取全細胞裂解液和蛋白，并用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白質的濃度。將不同濃度配合物處理過的蛋白樣品進行歸一化處理，向歸一化的樣品中加入SDSPAGE上樣緩沖液(1×)，隨后將蛋白樣品在95℃條件下加熱15 min。冷卻至室溫后，蛋白質樣品在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，12%分離凝膠和15%濃縮凝膠)上電泳，然后在電流(200 mA，1 h)和冰浴條件下，將蛋白轉印到PVDF膜上。膜轉移后，用脫脂奶粉(溶于5% PBST，即含吐溫-20的PBS緩沖液)密封蛋白2 h，然后選用合適的一抗將其稀釋至特定的濃度，將膜在一抗中孵育過夜使其與特異性蛋白結合。結束后，使用PBST緩沖液進行洗滌(5×8 min)。將洗凈的膜置于預先配制好的二抗孵育液中孵育1 h，再使用PBST緩沖液進行洗滌(5×8 min)。將等體積配制好的ECL顯影液覆蓋在PVDF膜上，孵育2 min后使用Power PacTM HC(新加坡)的BIO RAD成像，通過Image Lab軟件分析圖像。

2 結果與討論

2.1 合成與表征

選取具有抗腫瘤活性的3-吲哚甲醛[33-34]，將其與3-吡啶乙酸鹽酸鹽通過羥醛縮合反應進行化學修飾得到配體3-(2-吡啶-3-乙烯基)-1H-吲哚(Indole)；二聯吡啶釕前體Ru(bpy)2Cl2的合成參考文獻通過將RuCl3·3H2O與2，2′-聯吡啶在DMF中通過配位成鍵得到[35]；繼續將Indole與Ru(bpy)2Cl2在乙醇和水的體系中加熱回流重結晶提純，即可通過氮原子與釕原子進行配位成鍵的方式得到具有抗腫瘤活性的配合物Ru-Indole。合成路徑如圖1所示。通 過1H NMR及 ESI-MS對 配 體 Indole、前 體Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole進行了表征。

圖1 配體Indole及配合物Ru-Indole的合成路線Fig.1 Synthetic routes of ligand Indole and complex Ru-Indole

2.2 配體及配合物的光物理性質

研究金屬配合物的光物理性質有望實現配合物在細胞內的可視化跟蹤進而探究其對細胞的生理學功能[36-37]。我們使用紫外可見分光光度計及熒光分光光度計測試了配體Indole及配合物Ru-Indole的紫外吸收及熒光發射光譜，結果如圖2所示。圖2A為配體的紫外吸收及熒光發射譜圖，配體的紫外吸收波長為320 nm，熒光發射波長為490 nm。圖2B為配合物的紫外吸收及熒光發射譜圖。從圖中可以看出Ru-Indole的吸收帶范圍為260～550 nm，其中295 nm處的吸收帶歸屬于Ru-Indole分子中自旋允許的聯吡啶N^N為中心(1LC)的π-π*躍遷，在330 nm處的吸收帶歸屬于金屬到配體的電荷轉移(1MLCT及3MLCT)及配體到配體的電荷轉移(LLCT)[38]。同時發現配合物Ru-Indole在用450 nm的光激發時，在590 nm處有較強的熒光發射峰。這與無熒光發射的釕類配合物相比有望實現配合物在細胞內的可視化跟蹤成像。

圖2 配體Indole(A)及配合物Ru-Indole(B)在水溶液中的紫外吸收及熒光發射譜圖Fig.2 UV absorption and fluorescence emission spectra of ligand Indole(A)and complex Ru-Indole(B)in aqueous solution

2.3 配合物的脂水分配系數

化合物的親脂性是衡量細胞攝取量的重要指標[39]，研究表明，親脂性較強的物質更易透過細胞膜的磷脂雙分子層而進入細胞內，從而更有利于其發揮藥效[40]。反之，親水性較強的化合物，則不易進入細胞內。我們使用搖瓶法對配合物、配體及前體的脂溶性進行了測試，并用lgPo/w說明化合物的親脂性能。lgPo/w值是物質在正辛烷(油)和水中的分配系數的對數值，能反映物質在油水兩相中的分配情況。lgPo/w值越大，說明該物質親脂性越強；反之，lgPo/w值越小，則親水性越強[41]。結果如表1所示。該結果表明引入的配體有效地增強了配合物的脂溶性，從而使配合物更容易進入細胞；而前體Ru(bpy)2Cl2具有較小的lgPo/w值，說明其透過細胞膜的能力不如配合物Ru-Indole。

表1 配合物Ru-Indole、前體Ru(bpy)2Cl2及配體Indole的脂溶性數值Table 1 Lipid solubility values of complex Ru-Indole,precursor Ru(bpy)2Cl2 and ligand Indole

2.4 細胞毒活性研究

采用MTT法測定了配體Indole、前體Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole對宮頸癌細胞(HeLa)、人非小細胞肺癌細胞(A549)、乳腺癌細胞(MCF-7)、肝癌細胞(HepG2)及人正常肝細胞(LO2)在48 h的細胞毒性，并以順鉑cisplatin作為對照。由配合物IC50值結果(表2)可以看出，配體Indole及前體Ru(bpy)2Cl2對腫瘤細胞幾乎沒有表現出細胞毒性，其中Indole對幾種細胞的 IC50值均大于 100 μmol·L-1，Ru(bpy)2Cl2的IC50值均大于 200 μmol·L-1，這是因為 Ru(bpy)2Cl2的細胞攝取量較低，并且可能與細胞外的分子發生反應[42-43]。而當兩者配位后得到的配合物Ru-Indole對幾種細胞有5倍甚至10倍毒性的提高，對HeLa細胞的毒性最好，IC50值為20.2 μmol·L-1。此結果有望為新型抗腫瘤金屬藥物的開發提供設計思路[44]。為了探究配合物對幾種腫瘤細胞毒性提高的原因，我們對配合物Ru-Indole在細胞內的相關性質進行了進一步的研究。

表2 配體Indole、Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole在48 h后對不同類型細胞株的IC50值Table 2 IC50 values towards different cells after treated with Ru(bpy)2C l2,Indole,and Ru-Indole for 48 h

2.5 配合物的亞細胞器分布

了解藥物的細胞器富集情況有助于進一步研究其抗腫瘤活性的作用機理[45]，探討藥物的細胞定位常用的方法有激光共聚焦成像法和電感耦合等離子體質譜法等[46]。配合物Ru-Indole具有良好的光物理性質，在一定波長的光激發下可以產生熒光，因此我們首先通過共聚焦激光掃描顯微鏡研究了Ru-Indole在HeLa細胞中的亞細胞器分布情況。如圖3所示，配合物孵育細胞6 h后，細胞內就有較強的熒光信號，說明Ru-Indole具有良好的細胞膜通透性。當Ru-Indole的熒光信號分別與3種商用染料Mito-green、Lyso-blue及Hoechst 33342共孵育時，可以看出，Ru-Indole的紅色熒光信號與Mitogreen和Lyso-blue的熒光信號均具有較好的重疊，這說明Ru-Indole可以分布在線粒體和溶酶體中。為了進一步確定配合物在亞細胞器中的分布情況，我們又提取了Ru-Indole孵育12 h后HeLa細胞的細胞器，利用ICP-MS檢測了細胞器如細胞核、線粒體和細胞質中釕元素的相對含量，結果如表3所示。發現Ru在細胞質中的含量達52%(含溶酶體)，同時在線粒體中的含量達29%，這一結果與激光共聚焦成像的結果一致，證明配合物Ru-Indole在溶酶體和線粒體中均有富集，而在細胞核中富集量很少，這與文獻報道的結果是一致的[47]，同時為我們進一步推斷配合物的抗腫瘤活性作用機理提供了一定的實驗基礎。

圖3 共聚焦顯微鏡測試配合物Ru-Indole在各細胞器中的定位圖Fig.3 Confocal microscopy images of HeLa cells treated with Ru-Indole in different organelles

表3 ICP-MS測試配合物Ru-Indole在亞細胞器中的分布Table 3 Distribution of complex Ru-Indole in subcellular organelles using ICP-MS technique

2.6 配合物誘導HeLa細胞周期阻滯和凋亡

細胞周期分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。細胞周期與細胞的增殖有直接的關系[48]，有報道表明，通過對細胞周期的調控并將細胞周期阻滯在特定的分裂期可能是金屬抗癌藥物抑制癌細胞增殖的原因之一[49-50]。為了研究Ru-Indole對細胞周期的影響，我們使用流式細胞儀檢測了不同濃度Ru-Indole對HeLa細胞的周期阻滯效果，結果如圖4A所示。與對照組相比，當將不同濃度梯度的Ru-Indole孵育HeLa細胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，配合物誘導的G2/M期的細胞比例呈上升趨勢，但上升趨勢不明顯。當配合物濃度達到2倍IC50時，G2/M期細胞含量僅從22.9%上升至30.0%，配合物Ru-Indole不能明顯阻滯細胞周期，這說明Ru-Indole不是通過誘導細胞周期發生阻滯從而抑制腫瘤細胞的增殖。

細胞凋亡是細胞基因控制的程序性死亡，一些金屬藥物通過該路徑誘導細胞死亡從而發揮細胞毒性[51-52]。我們使用流式細胞儀檢測了配合物Ru-Indole誘導細胞凋亡及壞死情況，結果如圖4B所示。經不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的Ru-Indole處理24 h后，HeLa細胞的凋亡數目很少且保持不變，當配合物濃度為2倍IC50時，配合物活細胞的比例依然高達90.0%。因此，配合物Ru-Indole誘導癌細胞死亡的途徑不是凋亡而是其他途徑。

圖4 (A)配合物Ru-Indole對HeLa細胞周期阻滯效果;(B)配合物Ru-Indole誘導HeLa細胞凋亡圖Fig.4 (A)Effect of complex Ru-Indole on HeLa cell cycle arrest;(B)HeLa cell apoptosis induced by complex Ru-Indole

2.7 配合物誘導線粒體膜電位變化

從上述結果中得知配合物Ru-Indole不是通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡導致細胞死亡的，因此我們需要從其他方面來進一步探討Ru-Indole對細胞的影響。從藥物攝取結果了解到Ru-Indole有部分可定位于線粒體，因此我們猜測它可能對于線粒體造成損傷從而達到誘導細胞死亡的目的。JC-1是檢測細胞線粒體膜電位變化常用的檢測試劑盒，當線粒體膜電位較高時，JC-1以聚集體形式存在，同時發出紅色熒光(red)，而當線粒體膜電位下降時，JC-1會以單體形式存在，發出綠色熒光(green)，因此JC-1在2個通道熒光強度的變化經常被用來檢測細胞線粒體膜電位變化情況[53]。從圖5的結果可以看出，當我們用不同濃度的 Ru-Indole(0、10、20、40 μmol·L-1)處理 HeLa細胞時,未經藥物處理(0 μmol·L-1)的細胞的JC-1熒光主要為紅色熒光，而隨著配合物濃度的增加，綠色熒光強度呈現濃度依賴性增強，同時紅色熒光強度與綠色熒光強度的比值也隨著配合物濃度的增加逐漸減小，當Ru-Indole的濃度達到 40 μmol·L-1時，綠色熒光群的比例從 0 μmol·L-1的13.8%增加到42.1%。這表明配合物Ru-Indole具有誘導線粒體膜電位降低的功效，藥物通過線粒體通路作用是誘導細胞死亡的原因之一[54]。

圖5 配合物Ru-Indole對HeLa細胞線粒體膜電位的影響:(A)流式細胞術用于檢測線粒體膜電位變化情況;(B)線粒體膜電位降低柱狀統計結果Fig.5 Effect of Ru-Indole on mitochondrial membrane potential of HeLa cell:(A)Changes in mitochondrial membrane potential detected by flow cytometry;(B)mitochondrial membrane potential reduction histogram

2.8 配合物誘導細胞自噬

細胞死亡方式包含多種途徑：自噬、凋亡、壞死及鐵死亡等[55-57]，其中細胞自噬為常發生的細胞死亡方式。自噬是亞細胞膜結構發生動態變化并經溶酶體介導對細胞內蛋白質和細胞器降解的過程[58]。當發生細胞自噬時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ含量比值(wⅡ/wⅠ)的大小可評估自噬水平的高低[59]。前述的實驗結果表明細胞不是通過凋亡方式發生死亡的，因此我們進一步通過共聚焦成像和蛋白免疫印跡法研究了細胞自噬的情況。我們首先使用激光共聚焦顯微鏡探究了配合物Ru-Indole誘導HeLa細胞自噬的情況，結果如圖6A所示。與不加藥物的對照組相比，加藥組(20 μmol·L-1)處理后的細胞內綠色熒光強度有了明顯的提高，意味著細胞內產生了大量的自噬小體，這說明Ru-Indole誘導了腫瘤細胞的自噬。為進一步驗證該結果，我們使用蛋白免疫印跡法研究了配合物處理HeLa細胞后自噬蛋白LC3表達量的變化。圖6B實驗結果表明，與未經藥物處理的細胞相比，加入 10 μmol·L-1的Ru-Indole處理24 h后，LC3-Ⅱ表達量明顯提高。并且隨著配合物Ru-Indole濃度的增加，LC3-Ⅱ表達量的增加呈現濃度依賴的趨勢，同時wⅡ/wⅠ也明顯增加。使用Image Lab軟件計算定量分析后(圖6C)可以看出，隨著Ru-Indole濃度的增加，wⅡ/wⅠ明顯增加，配合物濃度與自噬水平之間存在劑量依賴關系，相對于0 μmol·L-1，Ru-Indole濃度為40 μmol·L-1時對細胞自噬蛋白表達量提高了13倍之多。以上實驗測試結果表明配合物Ru-Indole也可以通過誘導HeLa細胞自噬的方式誘導細胞死亡。

圖6 配合物Ru-Indole誘導的細胞自噬:(A)共聚焦顯微鏡成像圖;(B)蛋白印跡法成像圖;(C)LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ蛋白定量統計圖Fig.6 Autophagy induced by Ru-Indole:(A)confocal microscopy imaging;(B)western blot imaging;(C)ratio of LC3-Ⅱto LC3-Ⅰ (wⅡ/wⅠ)treated with Ru-Indole at different concentrations

3 結 論

我們將無毒性的吲哚類衍生物進行化學修飾后引入到同樣無毒的二聯吡啶釕前體中，得到了抗腫瘤活性明顯提高的釕配合物Ru-Indole，并對配合物的抗腫瘤機理進行了深入研究。研究結果表明，與配體及配合物前體相比，配合物Ru-Indole對腫瘤細胞的毒活性有了極大的提高，同時發現配合物可富集在線粒體和溶酶體中，可以誘導腫瘤細胞線粒體膜電位的降低，通過線粒體通路引起細胞死亡。同時通過激光共聚焦成像及蛋白印跡實驗發現配合物Ru-Indole還會引起腫瘤細胞的自噬從而誘導細胞死亡。總之，將吲哚衍生物引入到二聯吡啶釕配合物中，不僅提高了釕配合物的抗腫瘤活性，而且拓展了吲哚衍生物在配合物中的應用，為新型聯吡啶釕配合物在抗腫瘤方面的應用提供了一定的指導作用。