核酸適配體-熒光傳感技術在重金屬檢測領域的應用

李彤彤，孫曉紅，張彥瑾，趙 瑾，聶志勇*

(1.天津大學 化工學院，天津 300350；2.軍事醫學研究院毒物藥物研究所 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；3.軍事醫學研究院科研計劃處，北京 100850)

重金屬主要指鉛、鎘等密度大于4.5 g·cm-3的金屬[1]。隨著科技和工業的迅速發展，重金屬得到更廣泛的開采、開發和利用，由于前期過度開發及治理不到位，造成了較多的水源、土壤污染問題；同時由于重金屬生物蓄積性強，將持續對生物鏈和生態環境造成嚴重威脅。另外，由于某些重金屬離子無色無味、毒性大，亦成為投毒、中毒的重要恐怖物質[2]，如1994年清華大學才女朱令鉈中毒事件[3-4]、2010年廣東北江鉈重大環境污染事件[5]等。所以，重金屬的檢測鑒定在環境安全、反恐等方面具有重要意義。

基于人們生活、環境安全的考慮及重金屬離子的毒性差異，國家標準規定了生活飲用水、工業排放廢水中重金屬的含量，而國家推薦性標準的檢測方法主要是依靠大型儀器在實驗室中完成。隨著對環境問題的日益重視以及毒劑毒物檢測防控的需求[6-7]，除火焰光度、離子遷移譜儀等實時快檢裝備外[8]，包括可見[9]、紫外[10-11]、熒光[12]等試劑盒、試紙條檢測技術亦得到廣泛開發和利用。其中，指數富集配體系統進化技術為設計、篩選具有重金屬離子選擇性捕獲能力的核酸適配體提供了重要的理論基礎[13-15]，科研工作者已設計篩選出針對Ag+[16]、Hg2+[17-19]、Pb2+[20-22]、Cd2+[23]、K+[24]、Tl+[25]等在內的多種適配體(如表1)，這些適配體可與目標離子形成穩定復合物并折疊成特定的二級結構發揮識別功能，也可以依賴重金屬離子發揮核酶(脫氧核酶)作用。由于這些金屬離子與堿基的高特異性作用，基于該原理設計的檢測體系可以實現目標離子對其他金屬離子的出色選擇性。而這些適配體與熒光物質結合，又可使重金屬離子與適配體的相互作用轉化為熒光信號，這為核酸適配體-熒光傳感器的開發提供了廣闊的思路和設計空間。另外，在這些體系中使用納米材料可有效提高其性能。本文對近年來核酸適配體在重金屬離子熒光傳感器設計上的應用進行總結，重點介紹了標記型、非標記型及納米材料輔助等類型。

表1 重金屬及其核酸適配體Table 1 Heavy metals and nucleic acid aptamers

1 標記型適配體-熒光傳感技術

在標記型適配體-熒光傳感器中，標記后的核酸適配體具有靶標識別和信號轉換輸出兩方面功能。待測物通過誘導適配體構象發生變化，使標記的熒光團空間位置發生轉變，從而將待測物質信息轉換輸出為熒光信號。標記型適配體-熒光傳感策略又可分為單標記熒光團電子轉移猝滅原理、雙標記熒光團間的熒光共振能量轉移原理以及依賴重金屬的核酶(脫氧核酶)切割釋放熒光團原理。

1.1 單標記熒光團電子轉移猝滅型

單標記指將單一熒光團修飾在核酸適配體一端作為信號元件。利用該熒光團信號的增強或減弱來指示體系中目標物的濃度。該類熒光探針制備相對簡單，重現性良好。目前，常見的單標記適配體-熒光傳感器主要為“Turn off”模式，依據其原理可分為兩類：一是利用重金屬離子的直接誘導猝滅作用；二是利用設計的核酸適配體部分堿基片段的熒光猝滅特性，以重復鳥嘌呤片段及誘導后產生的G-四鏈體應用最為廣泛。

重金屬離子的直接誘導猝滅作用，一般指重金屬離子通過與核酸鏈的相互作用進而導致標記熒光團的熒光猝滅。相比于傳統熒光傳感器，直接利用重金屬離子猝滅游離在體系中的熒光染料，重金屬離子通過親和吸引帶負電的核酸鏈[26]，導致熒光團與金屬離子之間的距離縮短，從而發生熒光猝滅，其具有背景信號低、猝滅效率高等優點，且金屬離子與核酸鏈之間的親和力不依賴高特異性的核酸適配體，合成成本低。Li等[27]合成共軛芴通過酰胺鍵連接到核酸適配體上作為信號元件，無需標記猝滅基團構建單標記核酸熒光探針，利用核酸鏈和重金屬間的親和作用以及重金屬離子的直接誘導猝滅作用，實現了Pb2+的高靈敏度和高選擇性檢測。該類傳感器大多依靠結合親和力或熱力學識別目標金屬。Li等[28]發現不同金屬離子與單標記核酸鏈的結合動力學存在差異性，首次根據其結合動力學特征來區分金屬離子，將一端標記羧基熒光素(FAM)的隨機核酸鏈作為熒光探針，利用Cr3+的熒光猝滅動力學特性實現了湖水中Cr3+的檢測。該方法為金屬檢測和傳感器開發提供了另一個維度。

適配體上部分片段誘導熒光猝滅作用，主要是在核酸適配體上人為修飾具有猝滅特性的一段堿基片段，將該片段作為熒光信號猝滅元件,當與熒光團在合適的距離時，熒光團和堿基之間發生光誘導電子轉移(Photoinduced electron transfer，PIET)，使得熒光團的熒光被猝滅。其中依靠鳥嘌呤堆積的自身猝滅能力構建的單標記適配體-熒光傳感器應用最為廣泛。該策略的識別探針需包含兩段序列，一段為富含G的序列，一段為重金屬離子的特異性適配體序列；遠離富G序列的一端標記熒光團，作為信號元件，富G序列作為熒光信號猝滅元件。Zhu等[23]利用特異性核酸適配體在Cd2+存在時可從無規卷曲狀態變為莖-環結構，拉近熒光團和富G序列的距離，由于光誘導電子轉移，導致熒光猝滅。熒光響應與Cd2+的濃度成正比。Yang等[29]利用核酸適配體選擇性捕獲Hg2+，形成雙鏈結構可拉近熒光團和富G序列的距離，實現4.0 nmol/L Hg2+的檢測。Bian等[30]則借助Ag+可誘導適配體形成C-Ag+-C雙鏈結構和富G序列的熒光猝滅性能，實現水樣、藥物和食品中Ag+的檢測。Zhang等[31]利用該原理設計了同時檢測Pb2+和Ag+的六氯熒光素(HEX)單標記熒光探針，對于Pb2+和Ag+的檢出限分別為96、21 pmol/L。該體系不僅可選擇性地單獨檢測Pb2+或Ag+，而且可檢測其混合物。高密度鳥嘌呤堆疊的G-四鏈體的熒光猝滅能力強于單一鳥嘌呤，Wang等[32]利用該差異性實現了0.4 nmol/L Pb2+的檢測，以單標記羧基熒光素(FAM)莖環結構作為識別探針，莖部3′端的3個重復鳥嘌呤片段作為熒光猝滅劑，探針環部序列T30695(GGGTGGGTGGGTGGGT)可與Pb2+形成G-四鏈體；體系中不存在Pb2+時，發夾結構使鳥嘌呤接近染料而發生PIET，導致熒光強度降低。而體系中存在Pb2+時，環部序列折疊成G-四鏈體結構，熒光團在G-四鏈體上有效堆積，熒光被顯著猝滅。

單標記適配體-熒光傳感器無需進行熒光基團和猝滅基團的雙重標記，有效降低了設計及合成的難度及檢測成本。同時，該方法簡單快速，在檢測重金屬離子中具有廣闊的潛力。但現階段仍存在一些問題，如在熒光染料方面，部分標記型熒光物質的標記技術存在局限，只能在特定堿基上進行。還有部分具有優良發光、猝滅熒光性質的熒光物質的標記技術尚不成熟，限制了其應用[33]。此外在核酸適配體一端人為修飾一段序列，易影響適配體與靶標之間的親和力，進而干擾檢測的選擇性。因此需要針對熒光物質、熒光傳感策略、性能優化等方面進一步探索，開發、合成性能更佳的熒光物質，并設計優化核酸適配體鏈，以提高檢測的靈敏度和選擇性。

1.2 雙標記熒光團熒光共振能量轉移型

單標記傳感中，單一熒光團的光譜行為簡單，使得單標記熒光傳感體系在復雜體系中的應用受到了限制。近年來，雙標記熒光傳感體系得到了科學家們的青睞。傳統的雙標記核酸熒光傳感器由于其獨特的分子結構、性能以及良好選擇性被廣泛應用。核酸分子兩端標記基團分別充當熒光能量的供體和受體，當熒光供體的發射光譜與受體的吸收光譜有部分重疊，且這兩個基團之間距離在1～10 nm時，供體基團被激發后可通過耦合作用將其能量傳遞給受體基團，導致供體熒光猝滅，受體發射熒光，從而完成熒光共振能量轉移(FRET)。

熒光共振能量轉移的程度與供、受體分子的空間距離緊密相關[34]。Ono等[19]利用汞的核酸適配體與Hg2+形成雙鏈結構拉近兩端熒光團的距離，引起FRET，通過熒光強度的變化實現對Hg2+的檢測。除了通過雙鏈結構改變空間距離外，還可通過適配體被誘導折疊成的其他結構—G-四鏈體來引起FRET。Hoang等[25]篩選出對Tl+具有較高選擇性的核酸探針(PS2.M，5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3′)，在兩端分別修飾羅丹明(TMR)和FAM(如圖1)，Tl+誘導PS2.M折疊成G-四鏈體，引起518 nm處FAM的發射峰強度下降，585 nm處TMR的發射峰強度增強。以此熒光強度的變化實現溶液中59 μmol/L鉈離子的檢測。Liu等[35]設計篩選出可形成G-四鏈體的富含T的對Hg2+和Pb2+具有親和力的核酸鏈，并在兩端分別標記FAM和4-(4′-二甲氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)，首次實現以1條核酸適配體鏈同時檢測Hg2+和Pb2+。該體系還可包含多條適配體同時檢測多種重金屬，且互不干擾[36]。

圖1 基于適配體結構轉變引發FRET檢測Tl+的原理[25]Fig.1 Principle of Tl+ detection based on fluorescence resonance energy transfer caused by structural transformation of aptamer[25]

與單標記的熒光探針相比，雙熒光團標記的探針能更好地消除外界體系、核酸鏈分子、染料濃度等帶來的誤差。表1列出了一些單標記和雙標記的核酸適配體-熒光傳感器進行比較。雙標記體系增加了核酸適配體中修飾染料的種類和數量，往往存在修飾后的核酸鏈穩定性減弱的問題，同時雙標記的熒光基團也存在影響適配體與靶標結合親和力的問題。所以尋找穩定的染料以及更好的修飾方法是雙標記適配體熒光傳感技術發展的熱點。

表2 單標記、雙標記核酸適配體-熒光傳感器Table 2 Single and dual labeled nucleic acid aptamer-fluorescence sensor

1.3 基于特異性核酶(脫氧核酶)的標記型

除了借助核酸的識別功能外，還可利用依賴重金屬的特異性脫氧核酶(DNAzyme)構建酶型熒光傳感器。作為酶型傳感方法，這種熒光傳感器具有更好的專一性和更少的樣品消耗量。2000年，Lu課題組[20]利用依賴Pb2+的特異性DNAzyme構建了檢測鉛的熒光傳感器(圖2A)，將底物鏈5′端標記熒光團，酶鏈的3′端標記了猝滅基團，當底物與酶鏈雜交時，熒光團與猝滅基團相互靠近，使得熒光團的熒光被猝滅；在體系中加入Pb2+后，特異性DNAzyme在輔助因子Pb2+的作用下，催化底物鏈切割導致DNA鏈斷裂，繼而熒光團和猝滅基團分離，實現體系熒光恢復。但該體系由于底物鏈與酶鏈的結合是分子間雜交，因此整個體系的熱力學穩定性不高。為提高靈敏度，Lu課題組[37]后來在底物鏈上多修飾1個猝滅基團，確保游離的熒光團也能被猝滅以降低背景信號，該熒光傳感器對Pb2+的檢出限達35 nmol/L。Wang等[38]將底物鏈與酶鏈連接成環狀(圖2B),減少了多種熒光團的修飾帶來的合成成本，同時提高熱力學穩定性，檢出限為3 nmol/L。為實現更低的背景熒光，Zhang等[39]將底物鏈設計為分子內的莖-環結構，同時底物鏈兩端分別標記熒光基團和猝滅基團(圖2C)；該體系中所需酶鏈無需標記猝滅分子，可用少量酶鏈循環催化大量底物鏈水解，真正實現脫氧核酶的催化功能，同時提高傳感器靈敏度,該體系對Pb2+的檢出限為600 pmol/L。以上設計中，莖-環結構的熒光團與猝滅基團結合緊密，更能有效猝滅熒光，以獲得更低的背景熒光信號和更高的信噪比。

圖2 基于DNAzyme的Pb2+探針及其工作原理示意圖[20,38-39]Fig.2 Principle of Pb2+ probe based on DNAzyme[20,38-39]

除上述Pb2+的DNAzyme外，科研工作者還篩選得到Hg2+、Cu2+、Mg2+等金屬離子的DNAzyme[40-42]，與天然酶相比，核酶/脫氧核酶具有合成步驟簡單、理化性質穩定等優勢。此外，它們對金屬離子具有高度識別特異性。當特定金屬離子存在時，顯示出酶活性,且活性的大小與體系中的金屬離子濃度呈正相關，使得它們在金屬離子檢測傳感器研究中具有重要位置。目前該領域的重點研究方向仍是篩選、優化具有高催化活性、高識別特異性的核酶/脫氧核酶，以提高基于特異性核酶/脫氧核酶設計的相關傳感器的靈敏度、特異性及穩定性。

2 非標記型適配體-熒光傳感技術

熒光團標記核酸適配體，易影響適配體與靶標之間的親和力。為解決這一問題，非標記核酸適配體傳感體系得到了廣泛研究。非標記核酸適配體傳感器主要依賴核酸適配體在構象上的變化，包括二級結構的誘導形成以及空間位置的變化等，在無熒光團標記的情況下，利用外源熒光分子實現隨重金屬濃度變化而發生熒光信號的變化。傳統的熒光生色團在高濃度或聚集狀態下分子之間的π-π堆積相互作用促使激發態能量以非輻射的方式耗散，從而導致熒光猝滅，出現聚集誘導猝滅現象[43](Aggregation-caused quenching,ACQ)，且傳統染料分子作為熒光信號源常被光漂白效應破壞，這些現象曾嚴重制約發光材料的開發和實際應用。2001年，唐本忠課題組[44]發現一些特殊分子染料分散在溶液中時熒光微弱甚至觀察不到熒光，但聚集后熒光強度顯著增強，將這一現象稱為聚集誘導發光(Aggregation-induced emission，AIE)現象。具體機理是AIE分子以單體游離態被激發光激發后，被激發電子以分子內振動旋轉形式回到基態，不產生熒光；而當AIE分子發生聚集時，被激發的電子無法通過分子內振動旋轉釋放能量回到基態，只能通過輻射方式釋放多余能量，從而產生熒光。不少AIE分子在溶液中以陽離子形式穩定存在，能夠與DNA骨架上的磷酸根負離子發生靜電作用，形成核酸鏈-AIE的復合物，當功能核酸結合重金屬離子并折疊成特定結構(雙鏈DNA、G-四鏈體、i-Motif等，見表3)后，核酸適體鏈-AIE復合物的結構更加緊湊，使得AIE分子聚集，體系熒光強度顯著增強幾十甚至幾千倍。在一定范圍內，熒光強度的變化與重金屬的濃度線性相關。基于此開發的非標記適配體熒光傳感器具有信噪比高、抗漂白能力強的特點。

Li等[45]利用雙鏈螯合染料SYBR Green I(SGI)可插入汞誘導適配體形成的T-Hg2+-T雙鏈結構，顯著增強體系的熒光強度，實現了Hg2+的檢測。且SGI與純T序列雙鏈結構的親和力強于其他非純T序列[46]。SGI除可嵌入T-Hg2+-T、C-Ag+-C[47]結構外，還能與易形成G-四鏈體的核酸適配體鏈結合發生AIE現象，基于該原理可實現1.6 nmol/L Pb2+的檢測[48]。除了SGI外，其他一些染料也可插入緊湊的核酸適配體結構中。Ge等[49]添加硫黃素T(ThT)誘導結合富G序列折疊成G-四鏈體結構，發生AIE現象，體系呈現強熒光狀態。若體系中有Hg2+，則可特異性地將G-四鏈體轉化為T-Hg2+-T雙鏈結構，引起ThT的熒光強度降低(原理如圖3)。該方法可用于自來水和河水樣品中Hg2+的檢測，具有高靈敏度、寬線性范圍和良好選擇性。Li等[50]利用Zn-PPIX可嵌入Pb2+誘導的核酸適配體折疊成G-四鏈體后產生AIE效應，成功設計了Pb2+的熒光傳感器。一些基于該方法的傳感器中的核酸適配體序列、染料分子、檢測對象以及方法檢出限列于表3。

表3 AIE分子識別的DNA二級結構及檢測的重金屬離子Table 3 DNA secondary structure recognized by AIE substances and heavy metal ions detected

圖3 基于硫黃素T的AIE特性檢測Hg2+的非標記熒光傳感器[49]Fig.3 A label-free sensor for Hg2+ detection based on AIE induced by thioflavin-T[49]

標記型核酸適配體-熒光傳感器較為常用，但標記的熒光基團會干擾適配體的識別能力，且成本高，耗時、費力，這就使非標記適配體熒光傳感技術對于分析檢測領域具有非常重要的意義。基于特殊發光性質的染料分子或熒光基團的非標記適配體熒光傳感技術不僅克服了傳統的ACQ現象，而且能夠通過非標記熒光團與適配體體系簡單混合實現對目標物的低成本快速、靈敏檢測。非標記適配體熒光傳感技術正成為重金屬快速檢測分析研究的新方向。但就目前而言，可用的AIE分子相對較少且材料合成步驟繁瑣，報道的AIE分子大多發射波長較短,熒光量子產率低，半峰寬不夠窄,這為構建非標記適配體熒光傳感器帶來一定的困難。要實現復雜基質條件下重金屬離子的特異性檢測，還需科研工作者開發更多結構新穎、性能優良的免標記熒光材料來克服以上缺點。

3 納米材料輔助核酸適配體-熒光傳感技術

除了傳統的利用熒光染料和核酸適配體作用而構建的適配體-熒光傳感器外，納米材料因其良好的生物兼容性、穩定性等特性在適配體熒光傳感領域中具有標記或增強信號，提高靈敏度的作用，也被廣泛應用于重金屬檢測。常見的納米材料如貴金屬納米簇(AuNCs、AgNCs等)表現出優異的熒光特性，可作為新型熒光標記物；碳納米材料(如氧化石墨烯、碳納米管等)常作為固定核酸適配體的載體以及熒光猝滅劑，優化適配體的識別能力；量子點(Quantum dot,QD)等也可作為熒光傳感中的信號元件，提高檢測的靈敏度。

3.1 DNA穩定的金屬納米簇輔助

金屬納米簇具有良好的光學性能，在檢測分析應用中受到較多關注，可用于熒光檢測傳感器的構建。在無穩定劑的情況下，金屬納米簇將發生不可逆的聚集，而DNA是良好的穩定劑。DNA穩定的金屬納米簇輔助的熒光傳感器在檢測重金屬方面方便、快捷、靈敏，根據目標物對核酸-納米簇復合物的作用機理不同，產生的信號變化也不盡相同。目標物破壞復合物結構，引起熒光猝滅，可構建“Turn off”模式熒光傳感器；分析目標物存在下增強金屬納米簇的熒光，可構建“Turn on”模式熒光傳感器。

Zhu等[60]合成了核酸-金納米簇復合物(DNA-AuNCs)，若樣品中含有Hg2+，則與核酸適配體形成雙鏈結構，引起AuNCs的聚集，破壞復合物結構，使DNA-AuNCs溶液從藍色熒光逐步猝滅。該方法可實現0.083 μmol/L Hg2+的檢測，拓寬了檢測實際樣品中Hg2+的方法。除DNA-AuNCs，核酸-銀納米簇復合物(DNA-AgNCs)因熒光強度高、穩定性好且合成成本低也被廣泛應用于生物標記和化學生物傳感中。Zhang等[61]利用核酸適配體和Cu2+的相互作用可猝滅DNA-AgNCs的熒光，實現了河水樣品中Cu2+的熒光分析，且該體系對銅離子特異性強，其他離子干擾小。此外，有報道稱熒光銅納米顆粒(CuNPs)可與雙鏈DNA形成dsDNA-CuNPs復合物，表現出優異的熒光特性，可作為新型熒光標記物。Chen等[62]利用Pb2+對dsDNA-CuNPs熒光的選擇性猝滅作用，開發了一種無標記的熒光適配體傳感器，實現了尿液和河水樣品中5 nmol/L鉛的檢測。

除了一些重金屬離子可猝滅貴金屬納米簇外，還可以設計不同的核酸適配體，合成核酸-貴金屬納米簇，增強目標物的熒光，如Liu等[63]發現DNA-AgNCs納米簇靠近富G序列時，熒光增強約500倍。Yin等[64]在此基礎上發現2個DNA-AgNCs納米簇互相靠近時的熒光增強效果比靠近富G序列更好。基于相鄰DNA-AgNCs探針對的熒光增強現象，Zhang等[65]開發出銀納米團簇功能化的適配體熒光傳感器檢測Pb2+。該方法利用Pb2+誘導適配體折疊成G-四鏈體，使核酸鏈兩端的DNA-AgNCs相互靠近，導致熒光增強。通過熒光信號變化實現對Pb2+的痕量檢測。Deng等[66]則使用DNA雙鏈穩定的AgNCs作為熒光探針，實現對水溶液中Hg2+的高選擇性檢測。

隨著金屬納米簇合成工藝以及表面修飾種類的豐富與發展，使得越來越多的金屬納米簇輔助的熒光分析方法得以構建。

3.2 碳納米材料輔助

氧化石墨烯(GO)、碳納米管(CNT)、功能化氧化石墨烯、石墨炔等碳納米材料易溶于水，具有較好的生物相容性，可高效猝滅標記在寡核酸鏈上的染料的熒光，從而實現對靶標的熒光檢測?；诖颂攸c開發了多種檢測重金屬離子的熒光適配體傳感器。當無目標物存在時，單鏈DNA可通過核苷酸堿基和碳納米材料之間的疏水和π-π堆積相互作用自發地吸附到碳納米材料表面，使標記的熒光團猝滅以獲得較低的背景。重金屬誘導核酸鏈折疊成特殊二級結構后從碳納米材料上脫離，體系熒光得以恢復，以實現對重金屬的檢測。

Li等[67]利用GO作為吸附核酸載體以及熒光猝滅劑(如圖4)，該體系中不存在Pb2+時，適配體吸附在GO表面，熒光被有效猝滅。而當體系中存在Pb2+時，Pb2+將核酸適配體單鏈誘導折疊為G-四鏈體結構，使其脫離GO表面并恢復熒光，實現了對Pb2+的高靈敏檢測(檢出限為400 pmol/L)。CNT的超猝滅能力也被用于重金屬熒光傳感器的開發，Taghdisi等[68]利用單壁碳納米管(SWCNT)作為吸附核酸載體以及熒光猝滅劑檢測Pb2+。Pb2+通過將游離單鏈誘導折疊為對SWCNT親和力弱的G-四鏈體結構，使標記FAM的G-四鏈體從SWCNT的側壁脫離并恢復熒光，該體系實現了自來水和大鼠血清中Pb2+的檢測。利用碳納米材料的特性，還可開發用于檢測Hg2+[69]、Ag+[70]等的熒光適體傳感器。該體系還適用于多種單標記核酸適體探針同時檢測體系中的多種重金屬離子，熒光團的熒光強度對相應的離子濃度表現出良好的線性依賴性，且這些探針之間無干擾效應。Lu等[70]在GO輔助體系中加入多種單標記核酸適體探針，實現了Hg2+、Pb2+和Ag+的同時檢測。相較于GO，多壁碳納米管(MWCNT)具有更高的表面積，可裝載多個分子并猝滅所有染料，Wang等[71]報道了基于適配體-MWCNT的多色熒光傳感器，可實現同時檢測均相溶液中的Hg2+、Ag+和Pb2+(檢出限分別為15、18、20 nmol/L)。與單目標分析相比，多重分析可在單一溶液中檢測多種分析物，檢測快速簡單，樣品和試劑消耗量低。

圖4 基于氧化石墨烯和G-四鏈體檢測Pb2+的熒光傳感原理[67]Fig.4 Principle of fluorescence sensing of Pb2+ based on graphene oxide and G-quadruplex DNA[67]

3.3 量子點輔助

在傳統的熒光傳感器中，有機染料分子用作熒光信號源，常被光漂白效應破壞。標記型適配體熒光傳感器因合成成本高限制了其進一步的應用。近年來，量子點輔助開發的適配體熒光傳感器引起了很多關注，不僅因為QD具有出色的抗漂白性、量子產率高、熒光穩定性好、壽命長，而且因其穩定的理化特性可作為熒光信號元件免受光漂白。從結構的角度來看，常用的QD可分為核心型和核殼型。核心型QD通過表面活性劑包封合成，可以提供足夠的發光強度以實現有效的能量傳輸，但其因表面缺陷致使發光量子產率不高。而核殼型QD憑借其獨特的核殼結構可實現各層間的電荷轉移，提高了量子產率的同時保證了發光強度，廣泛應用于熒光傳感器的開發。CdSe@ZnS是一種典型的核殼QD結構。Li等[72]成功開發了CdSe@ZnS量子點輔助的檢測Pb2+的“Turn on”型適配體熒光傳感器。與“Turn off”型熒光傳感器相比，該體系的抗背景干擾能力更強，可實現90 pmol/L Pb2+的檢測。Liu等[73]則利用富G序列合成功能化CdS量子點(G-CdS QDs)，在K+存在下加入血紅素，形成G-四鏈體/血紅素復合物，電子從量子點轉移至血紅素，發生熒光猝滅。體系中存在Pb2+時，Pb2+可以誘導K+穩定的G-四鏈體/血紅素復合物發生構象轉變，從而釋放出血紅素輔助因子，被血紅素猝滅的G-CdS QDs的熒光將再次恢復，這種變化基于Pb2+和PS2.M之間的特殊相互作用，對Pb2+的響應幾乎不受其他金屬離子共存的影響[73]。Guo等[74]利用巰基乙酸(TGA)封端的CdTe QD實現了3.33 nmol/L Hg2+的檢測。開發易制備、易表征、量子產率高的材料，將為檢測真實樣品中的其他金屬離子提供巨大潛力。

納米材料輔助核酸適配體-熒光傳感可以解決影響標記型核酸適配體-熒光傳感的多種問題，與有機染料或抗體相比具有互補的優勢。基于熒光法本身的高靈敏度特性以及納米材料的特殊光電效應，使得納米材料輔助核酸適配體-熒光傳感技術在生物、環境等方面的分析應用具有較大的發展潛力。盡管貴金屬納米材料以及量子點已廣泛用于生物傳感的開發，但隨著納米材料種類的擴大以及檢測需求的增加，低成本的量子點新材料，反斯托克斯發光的上轉換粒子以及碳納米材料逐漸成為傳感器輔助材料的主流。將適配體與納米材料的光學特性相結合，可有效提高適配體的固定量，進一步改善生物傳感器向更低檢出限、更高靈敏度和小型化方向發展，具有巨大的潛力，在這一領域的研究必會得到越來越多的關注。

4 結語與展望

金屬作為潛在威脅物質，即使微量接觸的情況下,也可能對人類健康和環境構成嚴重危害。傳統檢測方法不能滿足重金屬離子的現場、快速、高靈敏度、高選擇性的檢測需求。功能化核酸的出現為提高重金屬傳感器的設計提供了新的思路和平臺。隨著適配體篩選技術的快速發展，篩選出具有高特異性、高親和力的核酸適配體成為可能。另外，納米技術的發展也為優良的熒光傳感體系提供了更好的發光或猝滅基礎。目前來看，未來熒光傳感技術在重金屬領域的應用，傾向于借助納米技術來優化體系的光學性能，提高方法的靈敏度，利用核酸適配體易于編輯、選擇性強等優點提高檢測方法的選擇性。總體來說，該技術仍存在一些亟待開發和解決的問題：一是砷和鉈等高毒性的重金屬離子適配體較少，選擇性較差或有待進一步優化，所以需要更優的核酸適配體設計及篩選技術；二是缺乏評估核酸適配體與靶標特異性結合的標準[75]，需要重視適配體的設計篩選與傳感器設計開發之間存在的差距，尋找特異性高、抗干擾能力強的核酸適配體；三是需將傳感器與試劑盒、試紙條、微流控芯片等結合，實現傳感器的微型化；四是實現檢測結果的高效傳輸與數據處理，以實現對復雜樣品的快速、現場實時檢測?？傊?，基于核酸適配體的熒光傳感技術在不斷的發展和完善，必將在生物醫藥、食品、環境等各個領域發揮巨大的作用。