鵝膏毒肽檢測方法的研究進展

劉潤卿,孫潔芳，牛宇敏，單文寵,3，邵 兵*

(1.首都醫科大學 公共衛生學院，北京 100069；2.北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013；3.中國農業大學 動物醫學院 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100193)

毒蘑菇中毒是最常見的食物中毒之一，也是食物中毒致死的最主要原因[1]。一直以來，全球范圍內毒蘑菇中毒事件頻發。1999年～2016年發生在美國的蘑菇接觸病例共有133 700例[2]。意大利[3]、瑞士[4]、愛爾蘭[5]等世界各國也時有發生毒蘑菇中毒事件。我國的云南、廣西、四川地區毒蘑菇中毒發生率也較高，且多發于夏秋季。2010年～2018年云南省毒蘑菇中毒人數占同期全部食源性疾病爆發事件發病總人數30.37%(9 686/31 892)，占總死亡人數50.00%(225/450)[6]。2012年～2017年江西省毒蘑菇中毒人數占同期食源性疾病爆發事件發病總人數13.0%(463/3 565)，占總死亡人數82.6%(19/23)[7]。毒蘑菇中毒發生率和病死率高，亞洲中毒患者治療后病死率仍可達28.4%[8]；發病快，臨床表現多樣，一些毒蘑菇中毒起病急、進展快、預后較差，因此患者中毒后及時進行毒蘑菇毒素的檢測，對患者的治療和預后至關重要。隨著科技的發展，傳統的檢測方法不斷推陳出新，新興的檢測技術也在蓬勃發展，為靈敏、精確、高效的毒蘑菇毒素檢測提供了有力的技術支持。

1 蘑菇毒素的分類及中毒機理

毒蘑菇種類眾多，且與可食用蘑菇不易區別，多因誤食而中毒。其中，大部分致死性毒蘑菇毒素為鵝膏肽類毒素。根據其氨基酸的組成和結構又分為9種鵝膏毒肽(AMA)、7種鬼筆毒肽和6種毒傘素。鵝膏毒肽是一種雙環八肽，通過與啟動環上的組氨酸殘基His1085結合[9- 10]，專一性抑制真核生物DNA聚合酶Ⅱ活性，導致其無法進行正常轉錄和細胞內蛋白質合成，從而誘發細胞死亡和肝功能衰竭[11]。鬼筆毒肽是雙環七肽，毒傘素為單環七肽，兩者專一性的與細胞中肌絲蛋白結合，破壞肌球蛋白與肌絲蛋白正常的聚合-解裂過程[12]，從而削弱細胞膜的功能，導致機體中毒。在致死性鵝膏肽類毒素中，致死性最強、含量最高的為α- 和β-鵝膏毒肽，因此對于毒蘑菇毒素的檢測主要為針對鵝膏毒肽的檢測。

圖1 鵝膏毒肽的化學結構(A)及不同種類鵝膏毒肽的取代基與半數致死量(B)Fig.1 Chemical structures of the amatoxin variants(A),and R-group designations for each variant and its median lethal dose(B)

2 檢測技術進展

2.1 鵝膏毒肽的色譜及其聯用技術進展

基于大型儀器的色譜及其聯用技術因具有進樣量少、靈敏度高、準確可靠的優點而在鵝膏毒肽的檢測中發揮了重要作用。但該類方法由于樣品前處理復雜、儀器操作技術要求高，不適用于現場快速篩查。

2.1.1 毛細管電泳檢測毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)檢測是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的液相分離、分析技術。Brüggemann等[13]首次嘗試用毛細管區帶電泳定量患者尿液和毒蘑菇提取物中的α- 和β-鵝膏毒肽。該方法分析需20 min，檢出限為1 μg/mL。Rittgen等[14]建立了一種分離鬼筆環肽、α-、β- 和γ-鵝膏毒肽的CE方法，優化后方法檢出限為13～79 ng/mL。Robinson-Fuentes等[15]建立的CE方法，能夠在7 min內測定尿液中的α- 和β-鵝膏毒肽。分離條件為毛細管間距75 μm，有效長度41 cm，總長度48 cm，25 ℃，20 kV，PDA檢測波長為214 nm。該方法的檢出限為1.5 ng/mL，定量下限為5 ng/mL，在5～100 ng/mL范圍內具有良好線性和選擇性。

2.1.2 氣相色譜檢測氣相色譜(Gas chromatography,GC)檢測是一種分離、分析技術。通過用惰性氣體作為流動相，使樣品組分在流動相和固定相之間瞬間達到平衡，是一種分析速度快、分離效率高的分離分析方法。Schwarzinger[16]采用熱裂解-氣相色譜/質譜對毒蘑菇毒素進行鑒定和分類，通過分析熱解、熱輔助水解和甲基化，建立毒蘑菇的色譜庫，對鵝膏毒素的檢出限可達3.5 ng。

2.1.3 高效液相色譜檢測高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測技術以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，各成分在柱內被分離后，進入檢測器進行檢測。Jehl等[17]研究了一種HPLC測定人血清、 尿液和胃液中α- 和β-鵝膏毒肽含量的方法。該方法在反相分析柱上進行分離，在280 nm紫外檢測條件下定量檢測，α- 和β-鵝膏毒肽的檢出限均為10 ng/mL。Abbott等[18]開發出一種HPLC方法檢測尿液中鵝膏毒肽的含量，為了更精確的定量，通過同位素內標法定量α-鵝膏毒肽，其內標為15N10-α-鵝膏毒肽，而β- 和γ-鵝膏毒肽不使用內標具有更一致的定量，檢測樣本的α-、β-、γ-鵝膏毒肽的檢出限分別為0.458、0.930、0.169 ng/mL。Garcia等[19]開發并驗證了一種HPLC紫外二極管陣列(Diode array detector,DAD)和電化學檢測的方法，用于定量大鼠肝臟和腎臟中的α-鵝膏毒肽，檢測步驟簡單、快速，適用于研究α-鵝膏毒肽的藥代動力學和組織分布。Morel等[20]采用HPLC在294 nm對蘑菇中的α- 和β-鵝膏毒肽進行分析，檢出限分別為20.5、29.1 ng/mL，回收率為83.0%～124.8%。

Li等[21]設計了一種分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymers,MIPs)作為HPLC固定相，具有識別和富集α-鵝膏毒肽的作用，通過HPLC分析檢測血清中α-鵝膏毒肽的含量，檢出限為3.0 ng/mL，線性范圍為10～500 ng/mL，回收率為88.5%～95.9%。因為MIP特異性識別界面的存在，即使在復雜的樣品基質中也表現出對目標物良好的選擇性。

2.1.4 液相色譜聯用質譜檢測液相色譜與質譜聯用技術(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)利用液相色譜作為質譜的進樣系統，使復雜的化學組分得到分離，利用質譜作為檢測器進行定量和定性分析，可提高檢測方法的靈敏度。

Li等[22]開發并驗證了一種靈敏、經濟的LC-MS/MS法檢測血清中的α-鵝膏毒肽，檢出限為3.0 ng/mL。Li等[23]使用液相色譜-光電二極管陣列檢測-離子阱和飛行時間質譜(Liquid chromatography-photodiode array detection-ion trap and time-of-flight mass spectrometry,LC-PDA-IT-TOF-MS)可實現同一樣品中多種鵝膏毒肽的準確識別檢測，該研究對毒素的裂解途徑和特征片段離子進行深入研究，獲得了更好的檢測效果。

Wang等[24]建立了一種應用固相萃取柱處理樣品，測定蘑菇樣品中蘑菇毒素(包括α-、β-、γ-鵝膏毒肽等)的LC-MS方法，檢出限可達0.07 mg/kg。Xu等[25]應用在線固相萃取/高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術(Solid phase extraction/high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry,SPE/LC-MS/MS)建立了超痕量α- 和β-鵝膏毒肽的分析方法，檢出限均為0.02 ng/mL，線性范圍為0.05～20 ng/mL。Zhang等[26]利用超高效液相色譜-串聯質譜(Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)聯合固相萃取柱PRiME HLB洗脫平臺，簡單、高通量地分析血漿、血清和尿液中3種鵝膏毒肽(α-、β-、γ-鵝膏毒肽)含量，實現了血漿中3種鵝膏毒肽低至0.5 ng/g的檢測。

Tan等[27]設計了一種基于β-環糊精協同MIP識別的固定相，應用UPLC-MS/MS方法實現血清、尿液以及肝臟中α-、β- 和γ-鵝膏毒肽的同時檢測，在尿液、血清、肝臟中的檢出限分別為0.16～0.33 ng/mL，0.34～0.42 ng/mL和0.035～0.056 ng/kg，分析速度縮短至8 min。

Xu等[28]制備了一種新的反相/苯基硼酸型混合模式磁固相萃取(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)吸附劑用于UPLC-MS/MS法檢測鵝膏毒肽(見圖2)。該方法的基質效應較低，靈敏度高，檢出限低(0.3 μg/kg)，從稱重、富集、純化到檢測，在20 min內即可完成一次樣品的檢測。該研究研制出一種吸附蘑菇等樣品中鵝膏毒素的MSPE材料，用硅烷化的POSS對氯甲基化微球(Fe3O4@SiO2)和磁性微球進行改性，將3-苯氧基苯甲醛和4-甲酰基苯甲酸偶聯，制備了RP/PBA復合型磁性微球(Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA)，使設計的吸附劑表面與目標物的結構相匹配。該吸附劑具有較大的吸附容量和良好的目標選擇性，在使用過程及使用后很容易通過磁分離，樣品前處理過程簡單、快速、高效，并有效地降低了LC-MS/MS測定中的基質影響。

圖2 特異性識別捕獲鵝膏毒肽的分子印跡材料構建(A);磁性Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA微球吸附劑特異性回收基質中鵝膏肽毒素及其后續與UPLC-MS/MS的聯用檢測示意圖(B)[28]Fig.2 Construction of molecularly imprinted materials that specifically identify amatoxin(A);schematic diagram of magnetic Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA microsphere adsorbent specific recovery for amatoxin in matrix and its subsequent detection combined with UPLC-MS/MS(B)[28]

2.2 鵝膏毒肽的快速檢測技術進展

2.2.1 基于鵝膏毒肽理化性質的快速檢測鵝膏毒肽基于理化性質的檢測技術主要有顯色反應、吸收光譜檢測和熒光檢測。這些方法通過一定的化學衍生手段實現鵝膏毒肽光譜性質的變化，具有簡單、快捷的優勢，但靈敏度低、特異性差，通常需與其他技術聯用。Wieland等[29]發展了一種簡單顯色檢測方法，將鮮蘑菇汁液印跡在紙上，干透后滴加濃鹽酸，如含有鵝膏毒肽毒素則10 min內顯藍色。雖然操作簡單，但靈敏度低，定量困難，僅可能適用于野外采集蘑菇的初步鑒定。 Vlaskin等[30]研究了一種基于熒光光譜快速檢測鵝膏毒肽的方法，通過將鵝膏毒肽加入溴化乙啶后會產生新的熒光波段,從而實現檢測。

紙層析和薄層層析(Thin layer chromatography,TLC)技術通過不同溶質與固定相和流動相之間作用力的差別，實現了不同物質在固定相上的分離。Wieland等[31]首次利用紙層析技術分離檢測毒素，層析結果采用1%的肉桂醛在濃鹽酸氣體中變色的顯色反應進行檢測。Sullivan等[32]最先采用薄層層析法分離檢測α-、β- 和γ-鵝膏毒肽。Stijve等[33]建立了一種快速、靈敏、高效的薄層色譜法測定鵝膏粗提取物中α-、β- 和γ-鵝膏毒肽含量，每種鵝膏毒肽的檢出限為50 ng。

2.2.2 基于免疫識別的快速檢測免疫識別檢測利用抗原抗體特異性識別對目標物進行檢測，具有特異性好、靈敏度高的優點，但易有交叉反應存在，也需考慮假陽性情況。放射免疫檢測法(Radioimmunoassay,RIA)是利用放射性核素的測量方法與免疫反應的基本原理相結合的一種放射性核素體外檢測法。Faulstich等[34]將鵝膏毒肽的衍生物與胎球蛋白結合作為兔抗原，具有較低的毒性和較高的免疫原性，所獲得的抗體與其他鵝膏毒肽不產生交叉反應。RIA提取純化的IgG結合在活化的尼龍表面，同時共價偶聯氚化的鵝膏毒肽免疫球蛋白進行免疫檢測，以用于生物基質中目標物的檢測，檢出限為3 ng/mL。RIA具有靈敏度高、特異性強、精確度佳等優點，但同時也具有價格昂貴、放射性核素對人體存在潛在危害性等缺點。

酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術具有靈敏度高、特異性好、簡單快捷等優點。Abuknesha等[35]在綿羊體內制備β-鵝膏毒肽多克隆抗血清，構建了間接競爭酶聯免疫吸附測定法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)測定人血清和尿液中的毒素，檢出限為80 pg/mL，與α-鵝膏毒肽的交叉反應性為22%。He等[36]研究了一種針對鵝膏毒肽的廣譜特異性單克隆抗體，鵝膏毒肽蛋白與包衣抗原競爭性地與單克隆抗體結合，該方法對α-、β- 和γ-鵝膏毒肽的檢出限分別為4.55、4.90、4.45 ng/mL。

Bever等[37]應用側向流動免疫分析(Lateral flow immunoassay,LFIA)技術快速檢測尿液中的鵝膏毒肽，在10 min內即可完成檢測，且無需對尿液進行任何預處理，對α- 和γ-鵝膏毒肽的檢出限為0.3 ng/mL，β-鵝膏毒肽的檢出限為1 ng/mL。

Zhang等[38]開發了一種快速、簡單的新型表面等離子體共振(Surface plasmon resonance,SPR)免疫檢測鵝膏毒肽的方法，構建單鏈可變區(Single-chain variable fragment,scFv)噬菌體抗體庫，篩選并分離了對鵝膏毒肽具有高特異性的重組抗體scFv-A4，以該抗體為基礎，所開發的SPR傳感器免疫檢測的靈敏度為ic-ELISA法的10倍左右，檢出限為0.17 ng/mL。該方法抗體制備簡單、重復性好，可快速提純，提升了免疫分析的靈敏度。

He等[39]同樣基于重組單鏈可變片段抗體scFv-A4，開發了以膠體金作為紅色標記的快速免疫層析法(Colloidal gold immunochromatography assay,CG-ICA)，可在10 min內完成檢測，實現了現場快速半定量測定蘑菇樣品中的鵝膏毒素。CG-ICA是一種基于競爭反應原理的快速半定量檢測方法。樣品中的鵝膏毒素與測試線上固定的α-鵝膏毒肽-OVA結合物競爭結合膠體金標記的抗體。與傳統的多抗或單抗CG-ICA相比，該方法制備的試紙價格低廉，重復性好。

2.2.3 基于特異性基因片段的檢測技術Wooszyn等[40]研究了一種基于基因編碼鑒定毒蘑菇中鵝膏毒肽的通用方法提取毒蘑菇中的DNA，再進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增，用于檢測鵝膏菌屬。He等[41]建立了基于鎖式探針(Padlock probe,PLP)的超支化滾動環擴增(Hyperbranched rolling circle amplification,HRCA)技術，用HRCA等溫法鑒定蘑菇混合物中的致命鵝膏毒肽，靈敏度比傳統PCR法高100倍。HRCA是一種等溫的指數擴增技術，通過逐個引物延伸和鏈置換的級聯反應，快速測定特定的核酸序列。掛鎖探針為大約100個堿基的單鏈線性寡核苷酸，由兩個序列組成，與目標序列的5'和3'端互補，并由遺傳連接區連接。當與目標雜交時，探針的5'和3'末端并列，并連接形成一個閉合的環狀分子。環狀探針可以在等溫條件下用DNA聚合酶進行HRCA指數級擴增。所設計的聚合酶鏈反應能夠識別所有的α-鵝膏毒肽基因序列，并能產生陽性HRCA反應，最終加入SYBR Green I誘導熒光產生，令HRCA結果無需瓊脂糖凝膠電泳即可直觀讀出，大大降低了氣溶膠污染的可能性。該方法無需昂貴的設備，可直接讀取信號，從而為條件較差的實驗室和偏遠地區的快速篩查提供了一種快速、特異、靈敏且經濟有效的工具。

2.2.4 基于分子印跡傳感器的快速檢測基于分子印跡傳感器的快速檢測以MIP實現的特異性分子間作用力或立體結構作為識別基礎，搭建各種傳感界面，應用不同信號傳導方式，實現基質中痕量鵝膏毒肽的識別、富集和檢測，具有快捷、可視化、高特異性和高靈敏度等特點，以滿足不同情況下的檢測需求。

Feng等[42]將碳量子點(Carbon quantum dots,CDs)嵌入印跡聚合物制備了特異性識別的熒光傳感器，用于直接檢測血清中的α-鵝膏毒肽，方法檢出限低至15 ng/mL。MIP中羧基和吡啶官能團可通過協同識別作用提高MIP對α-鵝膏毒肽的識別、捕獲能力，所制備的熒光傳感器無需任何預處理即可選擇性、靈敏地檢測血清中的目標物。

Qiu等[43]建立了一種基于石英晶體微天平分子印跡(QCM-MIP)傳感器用于檢測生物樣品中的鵝膏毒肽。首次利用烯丙基硫醇在QCM金電極表面附著可聚合的雙鍵，以合成的α-鵝膏毒肽為模板，4-乙烯基吡啶和A-甲基丙烯酸為雙功能單體，在金電極表面沉積MIP涂層。所構建的QCM-MIP對α-鵝膏毒肽具有良好的吸附性能，且重復性和穩定性好，在1.0～50.0 ng/L范圍內具有良好的線性響應，檢出限可達0.052 pg/L。

Qiu等[44]將MIP捕獲界面與光子晶體模板相結合，制備了MIP光子晶體傳感器(MIPC)，可實現2 min內對食品基質和生物基質中α-鵝膏毒肽的檢測，方法具有可視化、重復性好、靈敏度高等優勢(圖3)。該工藝以合成的部分α-鵝膏毒肽為模板，二氧化硅膠體光子晶體為載體，甲基丙烯酸(MMA)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸(EDMAA)為交聯劑，所合成的MIPC在乙醇溶液中與α-鵝膏毒肽吸附結合后能夠引發衍射峰發生位移，實現光學檢測。所制備的MIPC傳感器線性范圍寬(10-9～10-3mg/L)、檢出限低(5.0×10-10mg/L)、響應時間短(2 min)，在識別過程中伴隨著MIPC膜的顏色變化，從而實現了蘑菇、血清、尿液中靈敏的可視化檢測。

圖3 特異性識別捕獲鵝膏毒肽的分子印跡前處理材料的構建[21](A);MIP光子晶體傳感器對食品和生物基質中α-鵝膏毒素的可視化檢測[44]Fig.3 Construction of molecularly imprinted pretreatment materials for specific identification of α-amatoxin(A);visual detection of α-amatoxin in food and biological matries by MIP photonic crystal sensor(B)[44]

表1列出了近年來對鵝膏毒肽進行檢測的方法對比。

表1 近幾年鵝膏毒肽的檢測方法對比Table 1 Comparison of detection methods for amatoxin in recent years

3 總結與展望

鵝膏毒肽作為含量最高、致死性最強的毒蘑菇毒素，其檢測需求逐漸日常化、基層化。在實際臨床應用中，受限于實驗室條件、儀器設備及操作人員的專業技術水平，目前已有的檢測技術，特別是LC-MS/MS等技術，無法很好地滿足基層篩查需求。隨著科技進步，檢測技術不斷革新，從單一技術檢測單一毒素，逐漸發展為多技術聯合檢測混合毒素。這過程中，不斷簡化前處理方法，提高靈敏度和穩定性，縮短檢測時間，滿足不同基質的檢測要求，是新興檢測技術發展與創新的動力和追求。此外，操作盡量方便簡捷，也可為基層檢測的實用性、準確性提供保障。因此，在提高儀器檢測方法靈敏度的同時，更要關注快速檢測方法的創新，開發出更方便、更快捷、更準確的鵝膏毒肽檢測方法。