固相萃取材料在食品真菌毒素檢測中的研究進展

王友法,劉 通,母國棟,3,李銀龍,賀木易,楊敏莉,陸登俊,張 峰*

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.中國檢驗檢疫科學研究院 食品安全研究所，北京 100176；3.北京工商大學 輕工科學技術學院，北京 100048)

真菌毒素是絲狀真菌產生的一類有毒次級代謝產物，極易在農產品和飼料中產生污染，導致人類和動物發生嚴重的健康問題。當動物攝入被真菌毒素污染的飼料時，這些真菌毒素會被代謝成毒性更強的次級產物，并轉移到動物產品(奶和肉等)中，進而增大人類攝入真菌毒素的風險。根據聯合國糧農組織(FAO)的統計，世界上已有100多個國家制定了食品和飼料中真菌毒素的最大限量標準。我國2017版《GB 2761-2017食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中進一步降低了食品中黃曲霉毒素等常見真菌毒素的限量，除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(1 000 μg/kg)外，其它毒素的最大檢出含量均不得超過60 μg/kg。因此，需要開發精準的食品中真菌毒素分析方法實現有效監管。表1給出了中國、歐盟和美國對食品中常見真菌毒素的限量標準。

表1 食品中常見真菌毒素的致癌性歸類及中國、歐盟(EU)和美國(US)對其在食品中的限制水平Table 1 Carcinogenicity classification of common mycotoxins in food and limits standards in China，EU and US for mycotoxins in food

近年來，應用于食品中真菌毒素的檢測方法主要包括免疫分析法[1-2]、色譜法[3-4]和質譜法[5]等。其中，色譜法和質譜法可對食品中多種真菌毒素進行同時分析，具有檢測線性范圍寬和靈敏度高等優點，但對復雜食品中真菌毒素的檢測仍然存在較多的困難[6]。真菌毒素在食品中的濃度水平較低，易與復雜的基質成分結合產生基質干擾，進而嚴重影響檢測靈敏度[7]。因此檢測前需要進行高效的樣品前處理，以達到分離和富集目標物，消除基質干擾的目的。

目前，應用于食品中真菌毒素的樣品前處理方法主要有液液萃取法(Liquid-liquid extraction,LLE)和固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)[7-8]。LLE由于存在有機溶劑消耗量大、操作復雜以及易引入新的污染物等缺點，應用受到限制[7]。而SPE極大地簡化了樣品前處理步驟，并降低了有機溶劑的消耗，應用更為廣泛[7-8]。傳統的SPE主要是用C8、C18和苯基等有機基團鍵合二氧化硅等材料作為目標化合物的吸附材料，但這些材料存在重復使用率低、吸附容量少和穩定性差等缺陷。近年來，碳基納米材料、生物材料和高分子聚合物材料的發展促進了SPE在樣品前處理中的應用。這些新型SPE材料由于具有超小的尺寸、超大的比表面積、獨特的結構和功能特性等優點，極大地提高了對復雜食品基質中痕量或超痕量目標物的分離和純化能力[6]。盡管使用新型SPE材料從復雜樣品中提取多種目標物(如酚類、多環芳烴和農藥等)的相關綜述已有很多[9-14]，但對SPE材料在食品中真菌毒素樣品前處理方面的介紹還很少。為系統了解SPE材料在真菌毒素富集凈化中的應用進展，本文對近5年來報道的新型SPE材料在食品中真菌毒素樣品前處理中的應用進行了總結(表2)，對新型SPE材料的優缺點進行了比較(表3)，并對其未來的發展進行了展望。

表2 基于固相萃取材料的樣品前處理技術在食品真菌毒素分析中的應用Table 2 Application of sample pretreatment technology based on solid phase extraction materials in the analysis of mycotoxins in food

表3 食品真菌毒素檢測中不同固相萃取材料的對比Table 3 Comparison of different solid phase extraction materials before detection of mycotoxins in food

1 碳基納米材料

1.1 多壁碳納米管(Multi-wall carbon nanotubes,MWCNTs)

MWCNTs是由多層類石墨烯片卷曲而成的中空納米材料，具有尺寸小(納米級)、熱和機械穩定性優異、疏水表面積大和易于被表面修飾等優點[13-17]。Dong等[18]將MWCNTs作為固相萃取填料用于玉米、小麥和大米中4種A型單端孢霉烯類真菌毒素的富集凈化。在最優的SPE條件下，樣品回收率為73.4%～114%，檢出限(LODs)可達 0.01～0.03 μg/kg。該課題組為進一步提高富集效率和縮短前處理時間，采用聚合包裹機制，將磁性納米顆粒(Fe3O4)與MWCNTs進行超聲組裝，制備的磁性多壁碳納米管(Fe3O4@MWCNTs)可將萃取時間縮短至3 min[19]。此外，將特定的化學官能團(含氧基團等)修飾在MWCNTs的側面或底部，不僅能提高材料的穩定性和親水性，還可與目標物之間形成更多的相互作用，如氫鍵、離子交換作用等，增強其吸附能力和選擇性[20-22]。Zhao等[23]將用胺封端的聚乙二醇(PEG)對Fe3O4@MWCNTs表面進行共價官能化修飾，成功制備了一種新型磁性納米顆粒(Fe3O4@MWCNTs@PEG)。親水基團(羥基)的引入增強了Fe3O4@MWCNTs的穩定性和親水性，減少了材料的團聚現象。10 mg的Fe3O4@MWCNTs@PEG僅需3 min即可完成牛奶中13種真菌毒素的萃取(回收率81.8%～106%)，顯著降低了吸附劑用量。Li等[16]以3-(2,3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷作為中間連接體將聚乙烯亞胺(PEI)修飾在Fe3O4@MWCNTs上，制備了一種PEI改性的磁性多壁碳納米管(Fe3O4@MWCNTs@PEI),用于10種不同極性真菌毒素的富集凈化。PEI的引入使Fe3O4@MWCNTs表面含有豐富的羥基和氨基，這些基團提供了豐富的陰離子交換作用位點，增強了其對不同極性真菌毒素的提取能力。在最佳SPE條件下，樣品回收率為88.3%～104%，最大吸附能力為4.9～10.2 mg/g。此外，Fe3O4@MWCNTs@PEI還具有較好的重復使用性，6次重復實驗后提取效率無明顯變化。

總之，MWCNTs由于具有制備簡單、比表面積大和納米級結構等優點，被認為是食品中真菌毒素的優良吸附劑。但MWCNTs也具有易于團聚，選擇性和親水性較差等缺陷，嚴重限制了該類材料的使用[24]。因此，有必要尋找合適的官能團對其進一步修飾，提高穩定性、選擇性和親水性。

1.2 氧化石墨烯與還原性氧化石墨烯

氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)是石墨烯通過氧化反應獲得的產物，其表面豐富的含氧官能團(羧基、羥基和含氧基)使之具有較好的親水性，并提高了對目標物的選擇性和親和力[25-26]。然而，單獨的GO在SPE中易發生不可逆的團聚，影響實驗結果的可靠性和重復性[26-27]，因此需要引入納米顆粒或載體以防止GO團聚。Yu等[28]根據GO可通過靜電相互作用輕松包裹在3-氨丙基硅膠上的原理，成功制備了GO包裹3-氨丙基硅膠的復合材料(SiO2@GO)，并用于谷物中黃曲霉毒素(AFs)的萃取。附著在SiO2顆粒表面的GO納米片狀結構顯著提高了SiO2@GO的吸附能力，可在滿足樣品回收率的條件下(76.8%～107%)，將萃取時間縮短到10 min。Ma等[29]將GO涂覆在攪拌棒上用于豆漿中痕量AFs的高靈敏度檢測，在最優萃取條件下，樣品回收率為80.5%～102%，檢出限(LODs)為2.4～8.0 pg/mL。此外，GO涂覆攪拌棒具有較好的穩定性，重復使用10次樣品回收率無明顯變化。

還原性氧化石墨烯(Reduced graphene oxide,rGO)是GO經還原反應去除部分官能團而獲得的性質更穩定的一種新型石墨烯材料。rGO不僅保留了GO的部分含氧基團，而且具有更薄的厚度，這使得rGO具有較好的吸附性能[25,28]。Jiang等[27]將金納米顆粒引入到rGO表面制備了一種新型SPE填料(rGO@Au)，并用于牛奶中AFs等9種真菌毒素的檢測。對大多數真菌毒素而言，納米顆粒會增加rGO的層間距并減少團聚，從可而極大地提高復合材料的吸附性能，經rGO/Au純化的牛奶降低了基質效應(MEs:81.3%～102%),而α-玉米赤霉醇(78.0%)和β-玉米赤霉醇(68.1%)的基質效應仍不令人滿意，因此應對這類材料進行進一步修飾，以提高其選擇性。

類似于MWCNTs，GO和rGO由于具有制備簡單、比表面積大和表面富含氧官能團等優點，被認為是食品中真菌毒素的優良吸附劑。但GO和rGO同樣存在易于團聚和選擇性較差等缺陷[28,30-31]。因此，需要進一步官能化修飾，以提高其穩定性和選擇性，進而擴大兩者在食品中真菌毒素樣品前處理方面的應用范圍。

2 生物材料

2.1 抗 體

抗體常被用作免疫親和柱(Immunoaffinity column,IAC)填料應用于食品中真菌毒素的富集凈化，對特定真菌毒素具有高特異性親和力，因而可以較好地去除基質效應并實現較高的樣品回收率[32-35]。AlFaris等[36]采用IAC對嬰兒食品中的4種AFs進行富集和純化，結合超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)分析，有效消除了干擾峰，獲得了較高的樣品回收率(92.0%～103%)和檢測靈敏度(LODs:0.003～0.008 ng/mL)。Zhang等[35]通過雜交瘤技術制備了針對AFs、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)和玉米赤霉烯酮(ZEA)的單克隆抗體，然后將其與溴化氰(CNBr)活化的瓊脂凝膠4B進行偶聯，制備了一種對多真菌毒素具有特異性的抗體，實現了農產品中7種真菌毒素的快速同時富集純化，樣品回收率高達98.8%～102%。

抗體在食品真菌毒素的富集純化中展現出特異性強、選擇性好和富集效率高等優點，但也存在一定的缺陷，如價格昂貴、重復使用率低、易變性和降解等，嚴重限制了這種生物材料在SPE中的廣泛應用。因此需要進一步的改進，以降低成本，提高重復使用性。Liao等[37]為提高IAC的重復使用性，將使用后的IAC通過磷酸鹽緩沖液進行洗滌和保存，處理后的IAC可重復使用9次，且樣品回收率保持在70%以上，顯著降低了IAC的使用成本。Ren等[38]制備了一種抗獨特型納米抗體，通過噬菌體免疫聚合酶鏈反應(PD-IPCR)同時定量檢測了谷物中的黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，降低了抗體制備的難度，并實現了食品中多種真菌毒素的同時高靈敏度分析，更具有成本效益。

2.2 適配體

適配體是長度范圍為20～100個堿基的單鏈寡核苷酸。適配體的獨特序列使其能夠通過各種相互作用(包括堆積相互作用、氫鍵和范德華力等)與相應的目標物特異性結合，進而可用作分子識別生物材料[39]。此外，適配體還具有較好的親水性和易于被修飾等優點。近年來，研究者通過將適配體構建在不同的載體上(納米顆粒[40-41]和磁性材料等[42-44])，在食品中真菌毒素的樣品前處理中獲得了較好的應用。Xu等[41]制備了表面含有豐富硫醇基團的金納米顆粒適配體雜化親和材料，適配體覆蓋密度高達3 636 pmol/μL，可實現對復雜樣品中ZEA的高特異性在線富集分析(圖1)，且重復使用30次，樣品回收率均保持在90%以上。Khodadadi等[42]將適配體修飾在二氧化硅功能化的磁性Fe3O4表面，用于乳制品中黃曲霉毒素M1(AFM1)的富集凈化，在獲得較高樣品回收率(97.0%～116%)的同時將萃取時間縮短至8 min。

圖1 適配體基雜化親和材料的制備(A)及其對ZEA的在線分析流程圖(B)[41]Fig.1 Preparation of adaptor-based hybrid affinity material(A) and online analysis flow chart for ZEA(B)[41]

適配體在樣品制備中展現了諸多優勢和潛力，但仍存在一些限制條件[13,44]。首先，篩選對真菌毒素具有強親和力的適配體具有一定的困難。傳統的DNA庫不能提供較多種類的適配體，而多輪聚合酶鏈式反應(PCR)擴增程序可能會導致結合序列的丟失。其次，對適配體進行表面修飾時可能會降低識別區域的結合特性。此外，由于適配體基于核酸，因此暴露于存在核酸酶的食品基質中可能會導致適配體中核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。因此，還需要開發新穎的制備方法來進一步提高適配體的穩定性和可重復使用性。

3 高分子聚合物材料

3.1 分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers,MIPs)

MIPs是通過分子印跡技術人工合成的對特定目標分子(模板分子)具有特異性識別和選擇性吸附的聚合物。MIPs以其優異的化學和機械穩定性、對目標化合物的高特異性和良好的可重復使用性等，在食品中真菌毒素分析的樣品前處理中展現出優勢[45]。Rico-Yuste等[46]以4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酰胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯劑，尿石素C作為交鏈孢酚替代模板，制備了對交鏈孢酚和鏈孢酚單甲醚具有特異性識別作用的分子印跡聚合物。這種材料不僅具有較高的樣品回收率(67.0%～97.0%)，還具有優異的重復使用性(重復使用30次，吸附性能無明顯變化)。同時，使用價格更為低廉的替代物作為偽模板分子不僅降低了制備成本，還可防止因模板滲漏造成的分析結果偏高。Huang等[47]以磁改性的埃洛石納米管為載體制備了一種新型的磁性分子印跡復合材料(SPMIP)，用于谷物樣品中ZEA的快速高效凈化。SPMIP具有網狀多孔結構，其孔徑與ZEA分子相當。SPMIP表面豐富的氧原子可與ZEA上羥基的氫原子形成氫鍵，具有較高富集能力，最大吸附容量為13.473 5 mg/g。此外，磁性載體的引入，使SPMIP可以與基質溶液實現快速分離(100 s)，無需離心和過濾步驟，進而大大降低了樣品前處理的復雜性，縮短了處理時間。本課題組[48]將分子印跡修飾技術引入固體基板電噴霧離子源中，首次合成了分子印跡聚合材料涂布的不銹鋼片(MIPCS)，并研制出一種新型敞開式質譜離子源(MIPCS-ESI-MS)，實現了牛奶中5種氟喹諾酮類抗生素的靈敏、快速、準確檢測(圖2)。基于分子印跡技術和敞開式質譜技術，目前本課題組正在進行食品中真菌毒素高選擇性快速檢測方法的開發。

圖2 MIPCS-ESI-MS分析流程圖[48]Fig.2 Analysis flow chart of MIPCS-ESI-MS[48]

MIPs因具有制備簡單、成本低、穩定性好和選擇性高等優點，被認為是食品中真菌毒素的優異吸附劑。然而，MIPs在樣品前處理中的應用也存在一定的不足之處。首先，目前制備的多數分子印跡聚合物親水性較差，因此樣品基質中的水可以與MIPs上的功能基團形成氫鍵，進而占據其識別位點[13,49]。其次，模板分子不能有效去除，從而會降低MIPs對分析物的吸附能力，并對分析結果的準確性和可靠性產生影響[50-52]。因此，需要通過選擇合適的親水性功能單體、交聯劑和溶劑，制備能有效去除模板分子的親水性MIPs，進而使MIPs在真菌毒素樣品前處理中發揮更大作用。

3.2 金屬有機框架材料(Metal organic frameworks,MOFs)

MOFs是由金屬離子或簇與有機連接體組合而成的一種新型多孔晶體材料，具有化學結構和孔徑可調控，比表面積大和易于表面修飾等優點，是近年來的研究熱點[53]。合成MOFs的金屬離子和有機配體種類繁多，使得MOFs在結構設計和合成上具有很大的靈活性，進而可以根據目標化合物的特性選擇合成不同拓撲結構的MOFs，以增強其對目標化合物的選擇性和吸附性能[53]。然而，由于某些MOFs中的配位鍵較弱造成其在極性溶劑(水)中的穩定性較差，骨架容易坍塌，因此在使用MOFs作為SPE吸附劑時，通常需要進行表面修飾，以增強其在基質溶液中的穩定性[53-54]。Liu等[55]成功合成了一種半胱氨酸(Cys)功能化的鋯基MOFs(UiO-66-NH2@Au@Cys)，用于蘋果汁中棒曲霉毒素(PAT)的富集純化。Cys 的引入不僅提高了UiO-66-NH2的穩定性，而且提供了豐富的活性位點，包括氨基、羧基和羥基等，增強了吸附選擇性和吸附效率，吸附容量比基于微生物的生物吸附劑高10倍。Li等[56]通過sonogashira偶聯反應將微孔有機網絡(MON)引入到Fe3O4@UiO-66-NH2表面，制備了磁性復合材料Fe3O4@UiO-66-NH2@MON并用于食品中AFs的磁固相萃取。10 mg的吸附材料僅需10 min即可達到最大吸附量(16.3～19.6 mg/g)，樣品回收率為87.3%～102%。Liang等[57]以UIO-66-NH2作為表面接枝材料，槲皮素作為虛擬模板，丙烯酰胺作為共聚單體，制備了UIO-66-NH2@MIP吸附劑，用于食品中痕量AFs的富集凈化。該材料兼具MOFs的高比表面積和MIPs的高特異性優點，對AFs的富集效率明顯優于免疫親和柱、硅膠SPE柱、C18SPE柱和Florisil SPE柱。

MOFs由于具有超大的比表面積和有序的多孔結構等優點，在食品中真菌毒素的富集凈化中表現出廣闊的應用前景。與裸MOFs相比，功能化的MOFs在食品真菌毒素富集凈化中的穩定性和選擇性得到顯著提高。但對于MOFs和MOFs衍生材料仍需要解決一些問題，如穩定性低、制備成本高和選擇性有限等。設計和合成具有熱和化學穩定性好、選擇性高和可重復使用次數多的新型MOFs和MOFs衍生材料用于食品中真菌毒素的富集凈化，可能還需要更多努力。

3.3 多孔共價有機材料

多孔共價有機材料(Porous covalent organic materials,PCOMs)是一類由輕質元素(C、H、O、N等)通過強共價鍵鏈接而成的新型多孔有機聚合物材料，主要包括具有晶型結構的共價有機框架材料(Covalent organic framework materials,COFs)和無定型的共價有機聚合物等[10,14]。PCOMs由于具有密度低、比表面積大、吸附容量高、易于表面修飾以及結構可控和功能可調等優點，被認為是優異的SPE材料[10,14]。Wei等[58]以三[(4-甲酰苯氧基)甲基]乙烷和對苯二甲酰肼為單體制備了一種共價交聯聚合物，并將其用于大豆及其制品中AFs的富集純化。研究表明：制備的共價交聯聚合物通過π-π堆積、立體效應和疏水相互作用實現了較好富集凈化效果，樣品回收率為76.1%～113%，方法的LODs為0.08～0.20 μg/kg。Gu等[59]將金納米顆粒引入COFs表面后，又將MIPs修飾在金納米顆粒上，構建了用于測定AFB1的石英晶體微天平傳感器(QCM)(圖3)。由于COFs具有較大的比表面積，因此在其表面形成了較多的MIPs識別位點，從而對AFB1具有較高的樣品回收率(87.0%～102%)和檢測靈敏度(LODs：2.8 pg/mL)。此外，目前本課題組也在研究磁性COFs對食品中ZEA及其衍生物的富集凈化效果，并已證明其在牛奶和酸奶樣品中具有較好回收率(81.0%～90.3%)。

圖3 QCM的制備(A)及其對AFB1的檢測流程圖(B)[59]Fig.3 Preparation of QCM(A) and flow chart of AFB1 detection(B) [59]

相比于其它納米材料，PCOMs具有一些獨特的優勢，如在酸性和堿性條件下具有較高的熱和化學穩定性等[9-10,14]。但目前制備出的PCOMs及其雜化復合材料仍然具有一些缺陷，如有限的選擇性和固有的疏水性等，限制了其在食品中真菌毒素富集凈化方面的廣泛應用。因此，仍然需要通過進一步研究來提高PCOMs及其雜化復合材料的選擇性和多功能性。

4 總結與展望

真菌毒素及其代謝物在食品中廣泛存在，不僅給人類帶來了嚴重的健康風險，而且給農業產業造成了巨大的經濟損失。因此，快速準確檢測食品中真菌毒素及其代謝物的污染情況，顯得尤為重要。一方面，食品中真菌毒素含量低；另一方面，真菌毒素易與食品基質成分結合，掩蔽性強，為食品中真菌毒素的快速精準分析帶來了極大的挑戰。為了應對上述挑戰，吸附性強、選擇性高、吸附速度快的新型固相萃取材料迅速發展，這些新型SPE材料對食品中真菌毒素的富集純化顯示出高效的潛力，但仍需要進一步改善。首先，要實現高效的樣品固相萃取前處理，應開發功能化和可設計的新型吸附材料，提高其特異性和吸附能力。其次，可將幾種新型固相萃取材料相結合，制備成具有多種優異性能的復合材料。例如，MIPs與MOFs或PCOMs結合形成具有強特異性和高吸附性的新型萃取材料。另外，為了增強SPE材料在復雜食品基質和實際操作中的可用性和耐用性，需要提高其穩定性和可重復使用性。總之，日益發展的SPE材料已在復雜食品基質中痕量真菌毒素的富集凈化方面取得了重要研究進展，未來應針對性地設計制備穩定性更好、特異性更強和富集效率更高的SPE材料，以期在食品中痕量真菌毒素的快速、高效、精準檢測中發揮更大的作用。