基于表面增強拉曼光譜技術的芥子氣模擬劑快速檢測方法研究

劉 濤，顧家鐳，劉國坤，田中群

(1.廈門大學 化學化工學院，福建 廈門 361005；2.廈門大學 環境與生態學院，福建 廈門 361102)

化學戰劑是一類劇毒化學物質，在戰爭時期常被用作化學武器對敵方人員進行大規模殺傷，由其引發的各類恐怖襲擊事件也時有發生。化學戰劑的種類眾多，芥子氣作為一種糜爛性化學戰劑分子，其毒性極強，且化學性質穩定持久，會對人的呼吸道、皮膚造成長期損傷[1-2]?；诮孀託鈳淼目植劳{，實現該物質的靈敏、穩定現場快速檢測具有重要現實意義。

目前，針對芥子氣等化學戰劑的快速檢測技術主要有比色法、聲表面波傳感法、離子遷移譜法等。其中聲表面波和離子遷移技術發展較為成熟，已經在實際快檢中得到了應用。但這些方法只能進行初步的定性分析，缺乏高選擇性，往往會造成檢測結果的誤判。表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)具有分子指紋圖譜的高分辨率和近單分子水平的檢測靈敏度兩大優勢，已成為表面科學和生命科學等前沿基礎研究中的重要科研工具[3-5]。近年來，隨著便攜式乃至掌上型拉曼光譜儀的問世，SERS技術已被廣泛用于食品安全和公共安全等實際應用領域，有望成為一種現場快速檢測方法[6-7]。

基于SERS技術的芥子氣檢測方法已有相關報道：Van Duyne小組[8]利用納米球光刻技術制備了一種沉積Ag膜的SERS基底，并在便攜拉曼光譜儀上對芥子氣模擬劑2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)進行了SERS檢測；謝劍煒等[9]基于有孔Au@SiO2核殼型納米粒子，在溶膠體系中建立了一種針對芥子氣及其相關產物的現場檢測分析方法。目前，SERS技術檢測痕量化學戰劑類分子的主要策略可分為兩種。一種從提高分子有效檢測濃度角度考慮：發展前處理方法，對待測物進行有效分離和濃縮富集。另一種則是通過提高SERS增強的靈敏度和選擇性：(1)制備具有高電磁場增強能力的固態SERS基底，或在溶膠體系中加入各類酸堿鹽形成具有豐富SERS熱點的納米聚集體；(2)通過SERS基底的表面化學修飾方法誘導待測分子靠近熱點[10-13]?？紤]到實際現場快速檢測的需要，復雜的樣品前處理已無法滿足快速檢測要求，而SERS基底表面的化學改性往往針對具有特定結構和官能團的某類分子，雖提高了特定目標物的檢測靈敏度，但同時也降低了普適性，無法滿足復雜多變的現場檢測需求。

因此，本文從如何借助簡單的靜電相互作用提高目標分子在SERS基底的吸附能力這一關鍵因素出發，以芥子氣模擬劑2-CEES為探針分子開展相關SERS檢測研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

納米溶膠消光光譜的采集于日本島津公司生產的UV-2550紫外-可見光譜儀上完成；納米溶膠的形貌和粒徑分布則通過SEM(日本日立公司生產的S-4800場發射掃描電子顯微鏡)表征獲得；分別以高分辨拉曼成像光譜儀RAMAN-11(日本Nanophoton公司)和i-Raman plus便攜拉曼光譜儀(美國必達泰克公司)作為大型和便攜式拉曼光譜儀代表進行SERS檢測。

實驗所用各類試劑均為分析純及以上。2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)和鹽酸羥胺均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,2-CEES分子質量為124.63，密度1.07 g/cm3；NaBr、NaF、NaCl、NaI、KCl、MgSO4以及檸檬酸鈉、氯金酸均購自國藥化學試劑有限公司。溶液配制和用水均采用法國Millpore公司生產的Milli-Q純水儀提供的超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 金納米粒子(Au NPs)的制備

1.2.1 15 nm Au NPs的制備取31.6 mL水置于100 mL圓底燒瓶中，加入390 μL 1%(質量分數)的氯金酸溶液，劇烈攪拌下加熱至沸。5 min后，迅速加入1 280 μL 1%(質量分數，下同)的檸檬酸鈉溶液。0.5 h后，溶液由透明逐漸轉黑并緩慢變紅，最終得到亮酒紅色的Au NPs溶膠溶液。

1.2.2 50 nm Au NPs的制備將35 mL水、2 mL 1%檸檬酸鈉溶液、500 μL 0.1 mol/L 鹽酸羥胺溶液以及2.5 mL 15 nm Au NPs溶膠混合均勻后，在劇烈攪拌下緩慢滴加15 mL 0.042% 的氯金酸溶液(15 mL/h)，待反應完全后制得(50±5) nm的Au NPs。最后，將該金納米溶膠在4 500 r/min轉速下離心10 min除去溶液中過多的檸檬酸鈉，并加入等量超純水，于低溫密封保存備用。

1.3 2-CEES標準溶液的配制

取93.4 μL 2-CEES溶解在100 mL純水中得到1 000 mg/L的標準溶液，完全混合搖勻后用超純水逐級稀釋，得到不同濃度的標準溶液，低溫密封保存。

1.4 消光光譜及SERS光譜的獲得

取2 mL Au NPs溶膠加入潔凈石英比色皿中，加入1 mL超純水稀釋后于紫外-可見光譜儀上進行測試。

取1.5 mL 50 nm Au NPs溶膠離心(轉速4 500 r/min)10 min，去除上清液并于96孔板中定容至150 μL，依次加入50 μL待測物溶液和50 μL無機鹽團聚劑，混合均勻后立即進行SERS檢測。

2 結果與討論

2.1 Au NPs的均勻性、穩定性及重復性

由50 nm Au NPs的消光光譜(圖1A)可知，該NPs的局域表面等離激元共振(LSPR)峰位位于529 nm，半峰寬約為50 nm。與傳統一步法[14]得到的相似粒徑Au NPs相比，本工作得到的Au NPs的半峰寬明顯變窄，說明粒徑分布均一性更佳。SEM圖(圖1B)顯示所制備的Au NPs呈現近球形，表面分布一些不規則晶面；與之相應的粒徑分布統計柱狀圖(插圖)表明Au NPs的平均粒徑為(50±5) nm。

圖1 Au NPs的消光光譜圖(A)及SEM圖(B)Fig.1 Extinction spectrum(A) and SEM image(B) of Au NPs colloid insert：the related size distribution histogram

SERS檢測的穩定性和重復性是實現其實際應用的必要環節，這兩個參數主要依賴于SERS增強基底的穩定性和批間重復性。本研究首先測試了同一批次Au NPs的消光光譜圖，通過分析不同存儲時間點下各批次LSPR吸收峰位置的變化判斷Au NPs的穩定性，并根據不同批次Au NPs的消光光譜圖，統計了各批次LSPR吸收峰的位置。

圖2A為3個月存儲期內，4 ℃低溫條件下密封保存的Au NPs的消光光譜圖。由圖可知，存儲期內，Au NPs的LSPR吸收峰位置僅在528～530 nm范圍內波動(圖2A插圖)，其光學性能穩定性主要是來自于Au NPs表面吸附的負電性檸檬酸根及其氧化產物的保護作用(Zeta電位?-30 mV)。該結果表明3個月內，Au NPs的穩定性良好。進一步考察了9個批次Au NPs的消光光譜圖(圖2B)，根據圖2B插圖可知，LSPR吸收峰均處于528～530 nm范圍內，峰位置的波動范圍僅為±1 nm，表明Au NPs的批次間重現性良好。良好的穩定性和重現性為SERS檢測及潛在實際應用奠定了可行性基礎。

圖2 Au NPs隨保存時間(A)和批次(B)變化的消光光譜圖Fig.2 Storage time(A) and parallel preparation batch(B) dependent extinction spectra of Au NPs colloidinsert：the corresponding fluctuated SPR peak position

2.2 模擬劑2-CEES的常規拉曼測試及譜峰指認

與兩端都是氯乙基的芥子氣相比，一端是氯乙基一端是乙基的2-CEES(分子結構式如圖3插圖所示)保留了芥子氣基本的化學性質，同時其生理毒性顯著降低，因此常作為芥子氣模擬劑進行相關檢測研究。圖3為532 nm激光激發下2-CEES的常規拉曼光譜，可明顯觀察到位于653、699、753 cm-1處的特征峰。其中653 cm-1處的峰來自于C—S—C的拉伸振動模式，699、753 cm-1處的峰則分別對應于C—Cl的對稱和非對稱拉伸模式，同時包含C—S—C和C—H拉伸振動模式。975、1 038、1 054 cm-1處的峰來自于C—C的拉伸振動模式，1 290 cm-1處為C—H的彎曲振動模式。其中，位于600～800 cm-1區間的3個拉曼特征峰被視為芥子氣及其模擬劑的特征指紋譜峰，常被用于芥子氣及其模擬劑的定性識別[15-16]。

圖3 2-CEES液體的常規拉曼光譜Fig.3 Normal Raman spectra of 2-CEES liquid

2.3 模擬劑2-CEES的水解過程

在水溶液中，芥子氣及其模擬劑分子2-CEES不穩定，很容易發生水解。如圖4A所示，含孤對電子的硫原子首先與氯原子發生分子內親核取代反應生成帶正電的硫離子中間體，在此基礎上進一步水解成乙基，2-羥基乙基硫醚[17]。其中，硫離子具有強親電性，極易與生物大分子中強親核性的富電子原子發生反應，共價結合形成不可逆的烴化產物，該過程正是芥子氣分子的毒理學生理機制。

當將新鮮制備的150 μL微量(>10 mg/L)的2-CEES水溶液與50 μL Au NPs溶液混合時，Au NPs顏色迅速由酒紅色變為黑色，說明Au NPs發生了明顯的團聚，如圖4B插圖所示。該現象表明模擬劑在水中的水解速度較快，其中間體(正電性硫離子)通過形成Au—S鍵強吸附于負電性的Au NPs表面[18]，微量濃度水平的2-CEES即可破壞Au NPs溶膠的穩定界面雙電層，誘導其團聚形成SERS熱點，實現2-CEES的檢測。從圖4B可觀察到位于615、636、1 050 cm-1處的2-CEES特征拉曼譜峰。

圖4 2-CEES的水解過程和中間產物(A)及10 mg/L 2-CEES與Au NPs溶膠混合前后的SERS譜圖及其團聚狀態照片(插圖)(B)Fig.4 Hydrolysis of 2-CEES and the corresponding intermediates at different stages(A)and SERS spectra obtained before and after the addition of 2-CEES into Au NPs colloid(B)insert：the corresponding aggregation states

為了獲得更高的檢測靈敏度，實現從微量到痕量2-CEES的高靈敏檢測，考察了無機鹽團聚劑對提高2-CEES檢測靈敏度的作用。

2.4 模擬劑2-CEES的SERS檢測

由前期研究可知，在溶膠體系中，無機鹽常作為團聚劑破壞膠體雙電層，使膠體團聚，從而構筑SERS熱點實現目標物的痕量檢測。目標分子和團聚劑(無機鹽)的陰、陽離子在SERS基底表面的競爭和共吸附行為決定了該分子能否被高靈敏檢出[19]。

圖5 10 μg/L 2-CEES的SERS譜圖隨團聚劑種類(A)和NaBr濃度(B)的變化趨勢，以及以0.3 mol/L NaBr為團聚劑時SERS譜圖對2-CEES濃度的依賴性(C)Fig.5 The agglomerating agents(A) and NaBr concentration(B) dependent SERS spectra of 10 μg/L 2-CEES,and 2-CEES concentration dependent SERS spectra with 0.3 mol/L NaBr as agglomerating agent(C)

擇優選擇NaBr作為團聚劑，考察了2-CEES的SERS譜圖隨NaBr濃度的變化情況，結果如圖5B所示。位于610 cm-1的2-CEES拉曼特征峰強度并未出現明顯變化，說明在0.3～3.0 mol/L濃度范圍內，Br-與2-CEES在Au NPs表面的競爭共吸附行為未發生顯著變化，因此選用0.3 mol/L NaBr作為團聚劑。以Au NPs溶膠為SERS基底，其SERS譜圖隨2-CEES質量濃度的變化如圖5C所示。參考空白對比610 cm-1附近的特征峰強度可知，該條件下，2-CEES的最低可檢出質量濃度為10 μg/L水平。

考慮到化學戰劑現場檢測的實際情況和需求，基于上述工作，本研究在便攜式拉曼光譜儀上進行相關測試。如圖6A所示，對照金溶膠空白信號譜圖，在2-CEES 為0.1 mg/L時，610 cm-1附近的拉曼特征峰陡增，0.01、0.001 mg/L條件下可以觀察到640 cm-1處微弱拉曼峰的產生；1 000 mg/L時 610 cm-1處的峰強度減弱且640 cm-1處出現較強拉曼峰；在此過程中，位于1 050 cm-1處譜峰的強度隨2-CEES濃度的增加而不斷增強。以位于1 050 cm-1處的特征SERS譜峰為例，考察2-CEES的SERS譜峰強度隨質量濃度的變化關系，所得結果如圖6B所示。由圖可知，1 050 cm-1處拉曼峰強度隨2-CEES濃度的升高先增強后趨于平緩。采用Langmuir 方程對該趨勢進行擬合，獲得r2=0.997的良好效果，說明：(1)峰強隨濃度的變化符合Langmuir吸附等溫模型；(2)所研究濃度范圍內，2-CEES可能直接吸附于表面且未達到滿單層。位于610 、640 cm-1的兩個SERS譜峰的先后出現和拉曼峰相對峰強的變化可能意味著在Au NPs表面存在兩種不同吸附構型的2-CEES分子，具體尚有待于更深入的理論計算和實驗分析。

圖6 采用便攜式拉曼光譜儀，2-CEES濃度調控下的SERS譜圖(A)和1 050 cm-1處的歸一化拉曼峰強度的變化趨勢(B)Fig.6 Facilitated by a portable Raman spectrometer, the 2-CEES concentration dependent SERS spectra (A)and normalized Raman intensities of the 1 050 cm-1 peak(B)

對比圖5C和圖6A可知：便攜式拉曼和大型拉曼上得到的2-CEES的SERS譜圖和靈敏度基本一致，均在610 cm-1附近和1 050 cm-1出現了該分子的特征SERS峰；可穩定獲得10 μg/L水平的檢出濃度。該對比充分展示了SERS技術有望成為一種可對芥子氣進行高靈敏準確定性和半定量分析的現場分析手段。

3 結 論

本文制備了尺寸均勻、重復性佳和穩定性好的50 nm球形金納米粒子溶膠，以其為SERS增強基底，實現了對化學戰劑芥子氣模擬劑分子2-CEES的定性和半定量分析，獲得了μg/L級別的高靈敏準確定性檢出。本工作驗證了SERS技術用于芥子氣模擬劑快檢的可行性，為軍事上化學武器類毒劑分子的現場快速檢測提供了一種可靠的參考途徑。