薏苡仁中黃曲霉毒素G1的動態表面增強拉曼光譜檢測

任 菲，于治國*，陸 峰

(1.沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016;2.第二軍醫大學 藥學院，上海 200082)

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉菌的某些菌株產生的一類致突變、致癌的次級代謝產物[1]。黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)是其中具有代表性的一員，其毒性僅次于黃曲霉毒素B1(AFB1)，國際癌癥研究機構將黃曲霉毒素G1列為2B類毒素[2]。據報道，我國華北地區具有高發病率的肺癌和食管癌與黃曲霉毒素G1存在很大聯系[3]。進一步研究表明，黃曲霉毒素G1通過誘導AT-Ⅱ細胞DNA氧化損傷導致小鼠肺癌的發生[4]。薏苡仁中藥材在生長、采集、儲藏以及加工過程中易造成霉菌及霉菌毒素的污染，產生較多的黃曲霉毒素等霉菌毒素[5]。如諸晨等[6]在對比不同產地薏苡仁的黃曲霉毒素含量中發現安徽一批薏苡仁中黃曲霉毒素G1含量高達149 μg/kg，是黃曲霉毒素B1的4倍。同時薏苡仁為藥食兩用常用中藥材，使用范圍廣、用量大。因而對薏苡仁中黃曲霉毒素G1的監控具有重要意義。

目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法(ELISA)[7-8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]、液相色譜-質譜聯用檢測法(LC-MS)[10]、薄層色譜法(TLC)[11]等。這些方法雖有較高的靈敏度和準確度，但樣品提取和分離過程復雜，且凈化小柱的價格高昂，檢測時間長，儀器耗損大。因此，亟待建立一種適用于中藥材中黃曲霉毒素的快速且簡便的現場檢測方法。

表面增強拉曼光譜(SERS)是指光照射到納米級別的粗糙貴金屬(如金、銀等)的表面，引起拉曼信號顯著增強的異常光學增強現象[12]。SERS技術具有靈敏度高，熒光背景低，檢測速度快，提供化學指紋信息，儀器尺寸小適合現場分析等優勢，從而廣泛應用于藥品、食品、環境等領域。動態表面增強拉曼光譜技術(D-SERS)是在納米溶膠從濕態轉變到干態過程中實時進行的光譜采集，比SERS信號增加了2～3個數量級。本文利用簡單的擦拭法提取薏苡仁表面的黃曲霉毒素G1，以納米金為活性基底，采用D-SERS法檢測中藥材中黃曲霉毒素G1，該方法快速、簡便，在大批量樣品的現場分析中具有良好的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)及碘化鉀(KI)購自國藥集團化學試劑有限公司。黃曲霉毒素G1(bepure?)。實驗用水為去離子水。薏苡仁中藥材購買于藥店。

BWS415-785H便攜式拉曼光譜儀(必達泰克光電科技(上海)有限公司)，激發波長為785 nm，光譜分辨率為3 cm-1，光譜測量范圍為0～3 000 cm-1。Smart-D UV掃描電子顯微鏡(德國Carl-Zeiss公司)。

1.2 金溶膠的制備

金溶膠參考經典檸檬酸鈉還原氯金酸法制備并稍作改動[13]：向100 mL去離子水中加入4.8 mL 1% HAuCl4水溶液，邊攪拌邊加熱，待其沸騰時迅速加入4.3 mL 1%檸檬酸鈉溶液，繼續加熱攪拌，10 min后停止反應，自然冷卻至室溫，將所得酒紅色溶液倒入棕色瓶中儲存備用，制得50 nm金溶膠。

1.3 樣品前處理及D-SERS檢測

取約2.0 g中藥材薏苡仁，噴灑不同量黃曲霉毒素G1溶液并烘干，得薏苡仁中黃曲霉毒素G1的含量分別為8、20、40、80、160、320 μg/kg。乙腈作為潤濕劑潤濕薏苡仁表面，再用濾紙擦拭表面，將擦拭后的濾紙浸入乙腈中，并充分渦旋，讓附著在濾紙表面的黃曲霉毒素G1溶于乙腈。然后去除濾紙，將剩余乙腈溶液揮干，加入乙腈復溶。得到從薏苡仁表面提取的黃曲霉毒素G1濃縮液。

將金溶膠濃縮20倍后，加入10 μL 1 mmol/L KI溶液，并孵育30 min，與黃曲霉毒素G1提取濃縮液等量混合，滴在硅片上，將便攜式拉曼光譜儀的激光持續聚焦在液滴表面，激發波長為785 nm，激光功率為20%，積分時間為5 s，進行D-SERS信號采集。

2 結果與討論

2.1 金溶膠的表征

金屬納米粒子的尺寸、表面粗糙度等因素會影響其光學性質，因此對所制備的水相金溶膠進行掃描電鏡(SEM)和紫外光譜(UV-Vis)表征。結果顯示，制備的金納米顆粒呈球形且分布均勻，粒徑約為50 nm(圖1A)，紫外最大吸收波長在536 nm處(圖1B)。

圖1 納米金的掃描電子顯微鏡圖(A)及紫外吸收光譜(B)Fig.1 SEM image(A) and ultraviolet absorption spectra(B) of gold nanopartieles

2.2 黃曲霉毒素G1的D-SERS光譜與特征峰歸屬

將配好的金溶膠與2 μg/mL黃曲霉毒素G1溶液等體積混合，取2 μL混合液滴于硅片上，激光聚焦在液滴中間，采集光譜直到液滴完全變干，整個過程得到的D-SERS光譜如圖2所示。由圖可見，黃曲霉毒素G1信號呈遞增趨勢，達到最大值后維持一段時間，然后信號逐漸減弱甚至消失。此規律由楊良保等[14]最先發現：隨著溶劑的不斷揮發，納米顆粒間距離不斷縮小，因此在第一階段濕態下，待測物的信號不斷增強。當納米顆粒間距達1～10 nm時，進入了第二階段，即臨界狀態，此時所形成的熱點有較高的均勻度和較強的捕獲能力，使得檢測具有較高的靈敏度和重現性。隨后納米粒子間的距離進一步縮短，熱點也逐漸減少，拉曼信號迅速減弱，直到液滴完全變干，熱點消失。因此，臨界狀態具有一定的一致性和穩定性，選擇該狀態的光譜進行SERS檢測和分析十分可靠。

圖2 黃曲霉毒素G1的D-SERS光譜Fig.2 D-SERS spectrum of aflatoxin G1

表1 黃曲霉毒素G1的SERS光譜及固體標準品的常規拉曼光譜(NRS)的譜峰歸屬Table 1 SERS vibration modes attribution of aflatoxin G1 and normal raman spectrum(NRS) of solid standard

2.3 薏苡仁中黃曲霉毒素G1檢測方法的建立

由于中藥基質復雜，若直接從中藥粉末中提取總的黃曲霉毒素G1再進行D-SERS檢測，會得到很多中藥成分的干擾峰，甚至會覆蓋黃曲霉毒素G1的特征峰。因此，實驗選擇擦拭法提取中藥表面的黃曲霉毒素G1。這一方面是因為擦拭法是用濾紙擦試經過潤濕的中藥表面，僅提取附著在表面的黃曲霉毒素G1，相比其他方法需復雜的提取步驟以及固相萃取除去大部分中藥成分具有操作簡單、快速的優點；另一方面，擦拭法僅帶走藥材表面的成分，使得基質的復雜性以及含量均大幅減少，從而降低了對黃曲霉毒素G1檢測的干擾。

取6份薏苡仁，分別噴灑不同量黃曲霉毒素G1，得到薏苡仁中黃曲霉毒素G1的含量分別為8、20、40、80、160、320 μg/kg。在優化條件下，采用乙腈作為潤濕劑潤濕藥材表面，取0.5×0.5 cm2大小的濾紙擦拭藥材表面，再將濾紙浸入乙腈，然后將乙腈溶液揮干并復溶，得到含有系列濃度的黃曲霉毒素G1的薏苡仁提取濃縮液，并進行D-SERS檢測，結果如圖3所示。經過與空白對照對比發現，在薏苡仁成分的干擾下，黃曲霉毒素G1的大部分特征峰與干擾發生重疊，僅1 303 cm-1處信號無干擾，且信號較強，容易識別，因此選擇1 303 cm-1作為薏苡仁中黃曲霉毒素G1的定性定量特征峰。另外，隨著黃曲霉毒素G1濃度的增大，黃曲霉毒素G1的其他特征峰如1 475 cm-1和1 617 cm-1逐漸顯現并且響應也呈遞增趨勢，而薏苡仁的干擾峰相應地減弱。這可能是因為當黃曲霉毒素G1濃度足夠高時很容易占據金納米顆粒所形成的熱點，若更多的黃曲霉毒素G1進入熱點，就會與薏苡仁的成分競爭熱點，從而使薏苡仁的干擾峰相應減弱，進而凸顯出黃曲霉毒素G1的特征峰。由于1 303 cm-1處的響應隨著黃曲霉毒素G1濃度的遞增也呈遞增趨勢，因此以1 303 cm-1處特征峰峰強度(y)對應薏苡仁中黃曲霉毒素G1的含量(x，μg/kg)繪制標準曲線，發現黃曲霉毒素G1在8～320 μg/kg濃度范圍內呈良好的線性，線性方程為y=239.1x+1 730.7，相關系數(r2)為0.985 5(圖4)，檢出限(LOD，S/N=3)為5.5 μg/kg。傳統的液相色譜法前處理復雜，處理時間較長，還耗費大量有機溶劑，本方法雖在靈敏度略顯不足，但具有快速、簡單等優勢。另外，擦拭法提取薏苡仁表面的黃曲霉毒素G1并進行D-SERS分析，可達到靈敏性檢測要求，具有在現場快速檢測中藥材中黃曲霉毒素G1的能力。

圖3 薏苡仁中不同含量的AFG1的D-SERS光譜Fig.3 D-SERS spectrums of different contents of AFG1 in coix seed

圖4 10份樣品中檢測AFG1的重現性Fig.4 Reproducibility of aflatoxin G1 in 10 samples

2.4 薏苡仁中黃曲霉毒素G1檢測的重現性

實驗對真實樣品進行模擬染毒時，即黃曲霉毒素G1溶液噴灑在藥材表面并揮干，發現黃曲霉毒素G1會有少量滲入藥材內部，這與中藥材真實發霉的情況相符。因此在采取擦拭法提取藥材表面的毒素時會存在提取率降低和重現性差的問題。因此實驗同法配制了10份含有40 μg/kg 黃曲霉毒素G1的薏苡仁，在優化條件下采用擦拭提取和D-SERS檢測。結果發現，1 303 cm-1處特征峰的相對標準偏差(RSD)為11%，表明圖譜的差異性符合要求，該方法具有良好的重現性，可滿足薏苡仁中黃曲霉毒素G1的現場快速檢測。

3 結 論

本文采用擦拭法提取，建立了薏苡仁中藥材中黃曲霉毒素G1的D-SERS快速分析方法。在優化條件下，AFG1在8～320 μg/kg范圍內具有良好的線性，LOD為5.5 μg/kg。方法具有節約成本、快速、操作簡單等優勢，十分適合大批量樣品的現場實時快速分析，可為D-SERS技術在中藥材中黃曲霉毒素G1的檢測及開發奠定基礎。