METTL3-m6A途徑抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的實驗研究

陳悅，唐競桐，羅仕蓉

遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563006

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)指以肺動脈壓力和肺血管阻力增高等血流動力學(xué)紊亂為主要臨床特征的一系列臨床癥候群，目前已成為一個國際性的醫(yī)療保健難題[1]。PAH疾病進展的關(guān)鍵病理特征為肺血管重塑。肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)作為調(diào)控血管舒縮功能的關(guān)鍵，在PAH 的重塑過程中被激活，誘發(fā)PASMCs 的異常惡性增殖并刺激細(xì)胞的持續(xù)收縮，導(dǎo)致肺動脈血管壁增厚和管腔狹窄，最終引發(fā)肺血管壓力和阻力升高及右室負(fù)荷增加[2-3]。因此，如何靶向調(diào)控PASMCs 的惡性增殖能力抑制肺血管重塑是PAH當(dāng)前的重要研究前沿[4]。

6-甲基腺苷(N6-methyladine，m6A)作為中心法則中RNA轉(zhuǎn)錄后修飾的重要環(huán)節(jié)，是指在RNA腺嘌呤上第6 號位氮原子上加入或去除甲基團修飾的過程[5]。新近研究表明RNA 的轉(zhuǎn)錄后表觀調(diào)控方式可調(diào)控RNA 的轉(zhuǎn)錄后代謝全過程，包括對RNA 的轉(zhuǎn)錄后剪切出核[6]、穩(wěn)定性[7]、降解及翻譯[8]等。m6A受到多種促甲基化、去甲基化以及甲基化識別蛋白的動態(tài)調(diào)控。其中，甲基轉(zhuǎn)移樣酶3 (methyltransferase like 3，METTL3)作為促進m6A修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物核心，可促進RNA 的m6A 修飾介導(dǎo)RNA 的轉(zhuǎn)錄后代謝，參與多種疾病的病理過程。

METTL3 在多種腫瘤組織中可引發(fā)異常m6A 修飾促進包括胃癌細(xì)胞[9]、結(jié)直腸癌細(xì)胞[10]在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)。然而，METTL3介導(dǎo)的RNA甲基化修飾m6A 是否對于PAH 中PASMCs 的異常增殖功能是否具有調(diào)控作用尚不清楚。鑒于PAH 進展過程中PASMCs呈“腫瘤樣”細(xì)胞增殖改變促進肺血管重塑過程。本研究擬探索參與m6A 修飾的關(guān)鍵促甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3 是否參與PASMCs 的增殖調(diào)控功能，明確METTL3 依賴的m6A 修飾是否參與PASMCs 的增殖調(diào)控中，為靶向RNA 表觀轉(zhuǎn)錄后修飾機制在PAH治療中提供潛在的干預(yù)方式。

1 材料與方法

1.1 主要材料 6～8 周齡SD 大鼠共20 只(購置于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司)、DMEM 培養(yǎng)液(Gibco，11995115)、FBS (MRC，CCS30009.02)、DTT(Roche，10197777001)、Ⅰ型膠原酶(Sigma，1148089)、兔抗α-SMA(Abcam，ab5649)、兔抗METTL3(Abcam，ab195352)、m6A比色法檢測試劑盒(Epigentek，P-9005)、siNC/siMETTL3 (Ribobio，siG180122034132)、RNAi Max (Thermo，13778)、CCK-8 (凱基生物，KGA317)、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(Ribobio，C10310)。

1.2 大鼠PASMCs 的培養(yǎng)及鑒定 取6～8 周齡SD 大鼠共20 只(每次原代培養(yǎng)需6～8 只)，頸椎脫臼處死后采用75%酒精浸泡消毒，置入超凈工作臺中分離獲取肺動脈主干和左右肺動脈干，去除外膜結(jié)締組織內(nèi)膜后眼科剪反復(fù)剪碎為1 mm3。置入適量含0.14 mg/mL DTT、2 mg/mL BSA、8.53 mg/mL Ⅰ型膠原酶及0.2 mg/mL D-Hank's配制的消化液中吹打均勻，37℃水浴鍋中消化約90 min，每20～30 min觀察一次，待消化完全后，離心收集細(xì)胞加入適量含10%FBS+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。擴增至70%左右時傳代，利用差速貼壁純化細(xì)胞，將終止消化后的細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞懸液吸出加入到另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述操作2次。最后按1∶3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，隔天換一次完全培養(yǎng)液。取3～5 代細(xì)胞進行爬片，采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢 測α-平 滑 肌 肌 動 蛋 白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達以鑒定PASMCs的細(xì)胞純度。

1.3 細(xì)胞siRNA 轉(zhuǎn)染 將PASMCs 分為siNC 組與siMETTL三組，按照siRNA轉(zhuǎn)染試劑說明書分別配置10 μmol/L siNC及siMETTL3儲存液，根據(jù)25 cm2培養(yǎng)瓶大小，轉(zhuǎn)染試劑混合物配置為：2.5 μL siRNA儲存液+7.5 μ L siRNA 轉(zhuǎn) 染 試 劑(RNAi Max)+250 μ L DMEC 培養(yǎng)液。配置完成后加入適量不含雙抗的完全培養(yǎng)液中混勻待用。對融合70%左右的PASMCs進行換液，PBS潤洗一遍，加入上述配置好的含siRNA轉(zhuǎn)染混合物的DMEM 完全培養(yǎng)液，置入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用RT-qPCR 及Western blot 檢測METTL3的表達，驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 m6A比色法測定 采用m6A比色法試劑盒檢測下調(diào)METTL3 后PASMCs 總體m6A 修飾水平。細(xì)胞處理完成后，采用Trizol 法分別提取siNC 組及siMETTL3 組總RNA。將提取出的總RNA 定量后用RNase-free水或TE Buffer溶液稀釋至1～8 μL的樣品中，確保每個酶標(biāo)孔內(nèi)加入的RNA含量為200 ng。根據(jù)試劑盒使用說明，用1×Wash Buffer作為母液分別按需配置

Capture Antibody、Detection Antibody、Enhancer Solution、m6A的陽性對照以及Stop Solution等。提取并定量后的RNA，經(jīng)過m6A RNA的結(jié)合、捕捉及清洗等步驟、最終在酶標(biāo)儀上450 nm 處檢測吸光度的變化，并根據(jù)OD450吸光度值分別計算出兩組PASMCs m6A的相對表達量。

1.5 PASMCs 細(xì)胞增殖檢測 采用CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖功能。取3～5 代PASMCs，1%FBS 誘導(dǎo)細(xì)胞同步化后，接種于96孔板中，設(shè)置空白對照孔(不加細(xì)胞)、siNC孔以及siMETTL3孔，每孔加入5 000細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸液200 μL，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。采用上述方法分別轉(zhuǎn)染siNC 及siMETTL3 后加入含20%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8溶液37℃下繼續(xù)孵育1 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度；采用EdU檢測細(xì)胞增殖改變，根據(jù)上述分組將細(xì)胞接種于96孔中，按照EdU試劑盒說明分別加入EdU標(biāo)記孵育2 h，4%多聚甲醛固定，甘氨酸脫色后加入適量0.5%Triton通透10 min，PBS洗滌后加入Apollo染色反應(yīng)液染色，最后加入Hoechst染核后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間差異比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PASMCs 細(xì)胞鑒定 鏡下見細(xì)胞為梭形或長梭形，核居中，呈橢圓形或圓形，通過細(xì)胞免疫熒光檢測，見鏡下幾乎絕大多數(shù)細(xì)胞表達PASMCs 特異性標(biāo)志物α-SMA(圖1)。表明通過酶消化法可獲取純度較高的PASMCs用于后續(xù)進一步實驗。

2.2 siRNA 抑制METTL3 表達可下調(diào)PASMCs的m6A總體修飾水平 RT-qPCR結(jié)果顯示(圖2 A)，與

siNC 組比較，siMETTL3 組METTL3 mRNA 表達量顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示(圖2B、2C)，與siNC組比較，siMETTL3組目的基因METTL1的蛋白表達水平發(fā)生顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。m6A比色法檢測結(jié)果顯示(圖2D)，與siNC 組比較，siMETTL3 組m6A 修飾發(fā)生顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 下調(diào)METTL3 可抑制20% FBS 誘導(dǎo)的PASMCs細(xì)胞增殖 CCK-8檢測結(jié)果顯示(圖3 A)，與siNC 組比較，siMETTL3 組OD 值顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。EdU 檢測結(jié)果顯示，與siNC 組相比(圖3B～3C)，siMETTL3組EdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 PASMCs免疫熒光鑒定

圖2 siMETTL3效率驗證及對m6A修飾的影響

圖3 siMETTL3對PASMCs細(xì)胞增殖的影響

3 討論

PAH 已成為當(dāng)前心臟及呼吸系統(tǒng)疾病領(lǐng)域的重要防治難題，盡管其臨床分類多樣，但不同類型的PAH 間具有相似的病理生理基礎(chǔ)。在PAH 肺血管重塑過程中，PASMCs促增殖與抑制因素的調(diào)節(jié)平衡失調(diào)，導(dǎo)致PASMCs 發(fā)生異常惡性增殖。如何靶向調(diào)控PASMCs 的增殖失衡是當(dāng)前PAH 防治的重要環(huán)節(jié)。PAH與表觀遺傳的關(guān)系密切，既往通過靶向表觀遺傳機制應(yīng)對PAH 的防治研究取得重要進展[11-12]。例如DNA 層面的甲基化調(diào)控[13]、RNA 層面的非編碼RNA干預(yù)[14-15]以及蛋白層面的翻譯后修飾[16]等。

然而，關(guān)于RNA 轉(zhuǎn)錄后層面的表觀遺傳學(xué)修飾m6A 與PAH 的關(guān)聯(lián)及作用目前尚無報道。本實驗創(chuàng)新性的探討了表觀遺傳學(xué)中重要的轉(zhuǎn)錄后修飾類型m6A 否參與了PAH 肺血管重構(gòu)過程中PASMCs 的異常惡性增殖過程。以m6A 修飾的關(guān)鍵甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3 為切入點，探索了METTL3 在調(diào)控PASMCs的細(xì)胞增殖中的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用小干擾RNA下調(diào)METTL1的表達可顯著抑制PASMCs的整體m6A修飾水平，并進一步導(dǎo)致PASMCs的細(xì)胞活性及EdU陽性細(xì)胞比例降低。這些結(jié)果說明，敲低METTL3的表達可抑制20%FBS誘導(dǎo)的PASMCs增殖功能。研究表明，METTL3介導(dǎo)的m6A甲基化修飾效應(yīng)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要且復(fù)雜的角色[17]。METTL3不僅可促進胰腺癌細(xì)胞[18]和膀胱癌細(xì)胞[19]增殖及侵襲功能，還可促進子宮內(nèi)膜癌的增殖及致瘤性[20]。說明METTL3 在促進多種細(xì)胞的增殖調(diào)控中具有重要作用。我們的研究表明，敲低METTL3 的表達后，m6A 發(fā)生顯著下調(diào)的同時抑制了PASMCs 的細(xì)胞增殖功能。進一步夯實了METTL3 介導(dǎo)的m6A 甲基化在表觀轉(zhuǎn)錄后修飾中的作用。

本研究通過創(chuàng)新性探討中心法則中RNA 層面的甲基化修飾m6A 對PASMCs 的增殖異常參與肺血管重構(gòu)過程。基于METTL1 的PASMCs 靶向抑制或可為PAH的治療提供潛在的干預(yù)靶點。盡管如此，本研究尚有不足之處。METTL3 依賴的m6A 修飾如何影響PASMCs 下游關(guān)鍵的促增殖信號分子的RNA 代謝過程機制尚不清楚，有待后續(xù)深入研究。