芪參益氣滴丸聯合骨髓間充質干細胞移植改善小鼠心肌梗死有效性研究

何貴新 肖婷 秦偉彬 譚煒 林琳 任加以 陳天宇 吳凱 玉黎燕

急性心肌梗死是發病率、致死率很高的疾病之一，急診冠脈介入術的推廣使得急性心肌梗死的死亡率大幅下降。但存活患者的心功能無法恢復正常。干細胞治療的出現為急性心肌梗死的治療帶來新的希望。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)，具有在體外分化為心肌細胞的潛力，因此移植干細胞的最初設想是它們能夠在體內分化成為有收縮功能的心肌細胞，以代替損失的心肌細胞，進而恢復心臟收縮功能、逆轉心室重構[1]。盡管干細胞具有向心肌細胞和內皮細胞分化的潛力，但由于移植入梗死區存活的干細胞數量極少，其分化的效率和存活率均很低，因此限制了干細胞對于心肌梗死的治療效果[2]。

近些年來，中藥的心肌保護作用受到越來越多的關注。芪參益氣滴丸的四種主要成分為黃芪、丹參、三七、降香，其主要活性成分包括黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、人參皂苷Rg1、丹參酮ⅡA等，這些成分具有抑制細胞凋亡，維持正常能量代謝、抗炎、清除氧自由基等多種藥理作用[3-5]。心肌梗死后的局部微環境是非常惡劣的，能影響骨髓間充質干細胞移植后的歸巢和存活，同時梗死心肌局部的炎癥反應也阻礙了移植的骨髓間充質干細胞存活和分化。既往的研究發現單一的干預措施難以成功，而多途徑、多靶點的方法能優化干細胞的移植效率。鑒于芪參益氣滴丸具有上述多靶點多效應的作用，課題組提出假說：芪參益氣滴丸可以顯著改善心肌梗死后局部組織微環境，提高移植入梗死區干細胞的存活，從而起到優化干細胞移植效力，改善心功能的作用。此研究通過運用小鼠心肌梗死模型，評估芪參益氣滴丸對干細胞移植治療心肌梗死的優化價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究所涉及的動物實驗嚴格遵循美國國家衛生機構發布的《實驗動物保護和應用指南》(NIH Publication NO.85-23，1996年修訂)相關規定。本實驗所采用的動物均為C57BL/6雄性，SPF級，8周齡小鼠，均購自南京大學模式動物研究所，在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院SPF級動物房內飼養兩周后行本部分實驗。

1.2 主要實驗藥物

芪參益氣滴丸：黃芪、丹參、三七、降香油，天士力醫藥集團股份有限公司，批號：180615，每袋裝0.5 g。

1.3 主要儀器與試劑

小動物呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司)、小動物體表心電圖(上海玉研科學儀器有限公司)、氣體麻醉系統(上海玉研科學儀器有限公司)、可拍照光學顯微鏡(Olympus公司)、倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)、普通光學顯微鏡(上海點應光學儀器有限公司)，一抗Rabbit anti-CD3、anti-Ki67(Abcam公司)。二抗：Alexa Flour?594 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG (H+L，Invitrogen)、辣根過氧化物酶標記Goat anti-Rabbit IgG (H+L，北京中杉金橋)、DAPI(Invitrogen)、TUNEL試劑盒(Roche)、Trinton X-100(Sigma)。

1.4 分組及給藥

隨機將小鼠分為PBS組、干細胞組和干細胞聯合芪參益氣滴丸組，每組20只實驗小鼠。造模前10天開始灌胃，直至處死。干細胞聯合芪參益氣滴丸組予芪參益氣滴丸溶液(3.9 mg/mL，飲用水溶解)灌胃，PBS組和干細胞組予等量飲用水灌胃，每次灌胃0.1 mL/天。

1.5 小鼠心肌梗死模型及干細胞移植

造模前分離培養骨髓間充質干細胞，計數后PBS重懸，細胞密度為2.5×107個/mL，置冰上，轉移至動物手術室內。實驗過程中采用開胸結扎前降支的方法建立小鼠心肌梗死模型。10%水合氯醛腹腔注射，充分麻醉后將小鼠仰臥位固定于小鼠固定板上，脫毛膏脫去胸前及頸部毛發，消毒后縱向切開頸部皮膚，鈍性分離至氣管，可視下行氣管插管術，接小動物呼吸機輔助呼吸，參數為頻率110 bpm，吸呼比1∶1.2，潮氣量1.8 mL。沿肋骨走形方向，切開胸骨左緣第三、四肋間隙的皮膚，鈍性分離胸大肌，暴露肋間隙，眼科剪小心剪開肋間肌肉，開胸器撐開肋骨暴露心臟。眼科鑷子輕輕撕開心包膜，充分暴露左心耳。在左心耳下緣2 mm左右，用7-0帶針絲線垂直于冠脈走行方向，從冠脈下方的心肌內穿過并結扎。體表心電圖提示ST段抬高，并可見左心室前壁心肌變白，室壁運動減弱，提示結扎位置正確，建立心肌梗死模型成功。

使用30 G的進樣針(Hamilton)抽取20 μL干細胞懸液(約5×105個)，在梗死區和梗死周圍區取四個點均勻注射，每個點注射5 μL。PBS組抽取20 μL PBS，注射方法相同。注射完畢用無菌棉球按壓數秒。然后用4-0絲線逐層縫合肋間隙、胸大肌以及皮膚。待小鼠恢復自主呼吸后，撤出呼吸機保留氣管導管，意識清醒后拔除氣管導管。

1.6 觀察指標

1.6.1 血管新生觀察 觀察三周后處死實驗小鼠，留取心臟標本。4%多聚甲醛固定24小時之后，棄去固定液，沿心尖段、中段和心底段三個橫截面將心臟切成三段，室溫下脫水，透明，浸蠟，包埋，包埋蠟塊時從心底部至尖切成2段包埋，每組8個蠟塊，每個蠟塊至少制作3張切片(6個切面)。脫蠟、水化后，進行抗原修復：將浸泡在10 mM pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中玻片加熱，使之維持在95～99℃，10分鐘，取出、自然冷卻30分鐘，PBS潤洗5分鐘×2次，3%H202中孵育10分鐘，加入稀釋的二抗，37℃孵育60分鐘。加入DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色進展，一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中終止顯色。為了觀察骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植是否能影響梗死區和邊緣區的血管新生，行免疫組織化學染色，anti-CD31用于標記血管內皮細胞。

1.6.2 細胞凋亡檢測 切片脫蠟、水化同上，使用蛋白酶K(10～20 μg/mL)在21-37孵育15～30分鐘，PBS潤洗5分鐘×3次。準備TUNEL混合液：50微升酶溶液+450微升稀釋液，將TUNEL混合液加至組織切片上，完全覆蓋，37℃避光孵育60分鐘，加入DAB顯色，在熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白，將切片泡在蘇木精溶液中復染，切片用蒸餾水洗5分鐘×3次，風干后，中性樹膠封片。為了觀察骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植是否能影響梗死區(infarcted area)和邊緣區(border zone)的細胞凋亡，病理切片行免疫組織化學染色，TUNEL assay被用于標記凋亡細胞。通過熒光顯微鏡計數第21天時TUNEL+與GFP+重疊的細胞數，評價移植后MSCs在心肌中的凋亡情況，定量評價芪參益氣滴丸對移植后MSCs凋亡的影響。

1.6.3 細胞增殖檢測 為了觀察骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植對梗死區和邊緣區細胞增殖的影響，病理切片行免疫組織化學染色，anti-Ki67被用于標記增殖細胞。每個切面隨機選取6個不同的視野拍照分析，同時，每個蠟塊樣本隨機選取一張切片，選取6個不同的視野，采用LEICA Qwin V3 圖像分析系統，分析單位心肌面積內血管密度, 進行小鼠心肌梗死區、邊緣區微血管密度定量分析，計算小鼠心肌單位面積內微血管的密度。并且對梗死區和邊緣區Ki67陽性的細胞進行定量分析。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植對心肌梗死小鼠血管新生的影響

對梗死區微血管密度定量分析，結果顯示：PBS組與干細胞組組間比較差異有統計意義(P<0.01)；與PBS組相比，干細胞聯合芪參益氣滴丸組微血管密度明顯增加(P<0.001)；但與干細胞組相比，差別無統計學意義(P>0.05)，說明與注射PBS相比，移植MSCs能明顯促進梗死區的血管新生。

對邊緣區的微血管密度進行定量分析，結果顯示：PBS組與干細胞組組間比較差異有統計意義(P<0.05)；與PBS組和干細胞組相比，干細胞聯合芪參益氣滴丸組的微血管密度顯著增多(P<0.01和0.05)，說明與注射PBS相比，移植MSCs能促進邊緣區的血管新生，芪參益氣滴丸聯合移植MSCs能進一步增加邊緣區的微血管數量。見表1。

表1 骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植 對心肌梗死小鼠微血管密度定量分析

2.2 骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植對梗死小鼠細胞增殖的影響

對梗死區Ki67陽性的細胞進行定量分析，結果顯示： PBS組與干細胞組組間比較差異有統計意義(P< 0.01)；與PBS組和干細胞組相比，干細胞聯合芪參益氣滴丸組的細胞增殖明顯活躍(P< 0.001和0.05)。

對邊緣區Ki67陽性的細胞進行定量分析，結果顯示： PBS組與干細胞組組件比較差異有統計意義(P< 0.01)；與PBS組相比，干細胞聯合芪參益氣滴丸組Ki67陽性的細胞顯著增多(P<0.001)，說明與注射PBS相比，移植MSCs能明顯促進細胞增殖，芪參益氣滴丸聯合移植MSCs能進一步促進梗死區和邊緣區的細胞增殖。見表2。

2.3 芪參益氣滴丸對移植后骨髓間充質干細胞凋亡的影響

干細胞組共計數4406個GFP+細胞，其中TUNEL+細胞共2300個，占52.20%；干細胞聯合芪參益氣滴丸組共計數6059個GFP+細胞，其中TUNEL+細胞共2174個，占35.88%。組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，說明芪參益氣滴丸能抑制MSCs移植后凋亡的發生。見表3。

表2 骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植 對梗死小鼠細胞增殖的影響

表3 芪參益氣滴丸對移植后 骨髓間充質干細胞凋亡的影響(n=10)

2.4 芪參益氣滴丸對移植后骨髓間充質干細胞存活率的影響

PBS組未見有GFP+細胞，干細胞組共計數了45827個DAPI+細胞，其中GFP+細胞為4872個，占10.63%；干細胞聯合芪參益氣滴丸組共計數了49546個DAPI+細胞，其中GFP+細胞為7284個，占14.70%，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，說明芪參益氣滴丸能提高MSCs移植后的存活率。見表4、圖1。

表4 各組小鼠心肌內骨髓間 充質干細胞(MSCs)的存活情況 (n=10)

注：藍色熒光為DAPI，代表細胞核；綠色熒光為GFP，代表移植的MSCs。

3 討論

既往研究表明，干細胞在體外具有自我更新、無限增殖以及分化為多種細胞的潛能[6]，大部分研究都把干細胞可以作為心肌再生的可靠來源。骨髓間充質干細胞(MSCs)是目前研究的最多的干細胞，臨床和動物研究都表明干細胞移植確實能改善心功能、抑制心室重構[7-8]。盡管MSCs具有向心肌細胞和內皮細胞分化的潛力，但由于移植入梗死區存活的MSCs數量極少，其分化的效率和存活率均很低，因此限制了MSCs對于心肌梗死的治療效果[9]。如何提高移植MSCs的療效是亟待解決的問題。在本研究中，課題組觀察了骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸移植治療急性心肌梗死小鼠的有效性。與移植MSCs相比，芪參益氣滴丸聯合移植MSCs能進一步增加邊緣區的微血管數量，抑制梗死區的細胞凋亡，以及促進梗死區和邊緣區的細胞增殖。實驗結果充分說明在治療小鼠急性心肌梗死方面，芪參益氣滴丸聯合移植MSCs的療效優于單純移植MSCs。

心肌局部的微環境能影響MSCs的歸巢和存活，炎癥反應、活性氧簇都能誘發MSCs凋亡，也能影響MSCs向心肌細胞轉化的效率。研究者試圖在體外對干細胞進行一系列修飾，以增強其生存能力[10]，或者通過注射調控蛋白改善局部微環境，從而提高干細胞的存活率[11]，或者抑制局部的炎癥反應，使得干細胞免受炎癥因子攻擊[12]。盡管實驗發現上述措施都是有效的，其臨床應用卻存在諸多困難。不過這些研究表明，改善心肌局部的微環境是提高MSCs存活的有效途徑。

目前，中藥的心肌保護作用受到較多的關注。芪參益氣滴丸是一種臨床上常用于治療急性心肌梗死和慢性心衰的復方中成藥，其四種主要成分為黃芪、丹參、三七、降香，藥理學實驗提示其有效成分具有抑制細胞凋亡、維持正常能量代謝、抗炎、清除氧自由基等多種藥理作用。芪參益氣滴丸也能通過調節心肌細胞能量代謝[13]，抑制細胞色素C釋放[14]，保護線粒體結構和功能，減少白細胞浸潤，從而減輕缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡。有效成分丹參酮 ⅡA可增加B淋巴細胞瘤-2蛋白表達，下調急性心肌缺血時BCL-2同源的水溶性相關蛋白的表達，從而減少心肌細胞凋亡[15]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是參與心肌缺血損傷過程的重要的細胞成分之一，三七總皂苷通過抑制NF-κB 的活化，減少內皮細胞損傷而起到心肌保護的作用[16]。三七總皂苷還能通過升高中性粒細胞內的環磷酸腺苷，減輕脂質過氧化損傷，抑制氧自由基生成，而抑制其釋放炎癥因子，減輕心肌細胞損傷[17]。由于芪參益氣滴丸具有上述多靶點多效應的作用，因此課題組提出假設，芪參益氣滴丸可以顯著改善心肌梗死后局部組織微環境，提高移植入梗死區干細胞的存活，從而起到優化干細胞移植效力，改善心梗后心室重構的作用。本實驗也證實了此假說，骨髓間充質干細胞聯合芪參益氣滴丸治療心梗后心室重構的療效優于單獨行MSCs移植。