補腎調肝方對卵巢儲備功能下降大鼠卵巢/海馬功能及PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

劉柳青 劉雁峰 潘雪 許夢白 吳豆豆 楊綠

卵巢儲備功能下降(diminished ovarian reserve，DOR)是指卵巢內存留的、可募集的卵泡數量減少和(或)卵母細胞質量下降，可引起流產率升高[1]和輔助生殖妊娠不良結局[2]。近年來，精神心理因素在DOR發病中的作用逐漸受到重視。研究證實，社會心理因素會引起慢性心理應激、造成DOR[3-5]，而DOR患者亦常伴有焦慮、抑郁等情緒[6]。從中醫角度看，本病以腎虛為基本病機，與肝、脾、腎等臟腑密切相關，腎虛肝郁是DOR的重要病機和常見證型[4,7]。

本團隊通過前期臨床觀察發現，采取補腎調肝方治療DOR可取得較好療效，在改善DOR患者卵巢功能、伴隨癥狀及生存質量等方面效果顯著[8]，但其作用靶點及起效機制尚不清楚。因此，本研究立足DOR患者生殖能力下降與慢性心理應激狀態并存的臨床特征，建立DOR合并慢性心理應激大鼠模型，基于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K),蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyclin,mTOR)的PI3K/AKT/mTOR信號通路，從卵巢儲備和神經內分泌兩個角度，探討補腎調肝方改善卵巢、海馬功能的作用靶點和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級大鼠60只，雌性，7周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2016-0006]。適應性喂養7天后，每日常規查看陰道涂片以觀察大鼠的動情周期。將49只具備連續兩個正常動情周期(4～5天)的大鼠納入正式實驗。

1.2 倫理審查

實驗方案經北京中醫藥大學動物倫理委員會批準，倫理審批號：BUCM-4-2019022803-1033。

1.3 實驗藥物

雷公藤多苷片，10 mg/片，湖南千金協力藥業有限公司，批號：20190603。戊酸雌二醇片，1 mg/片，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號：555A。地屈孕酮片，10 mg/片，Abbott Biologicals B.V.(荷蘭)，批準文號：H20170221。補腎調肝方(配方顆粒)：熟地黃15 g、黃精15 g、枸杞子15 g、桑寄生15 g、郁金12 g、丹參20 g、鱉甲20 g、葛根10 g。由東直門醫院免煎顆粒室提供，北京康仁堂藥業統一制備，密封保存備用。

1.4 實驗試劑

大鼠五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)ELISA試劑盒(武漢基因美科技有限公司)、大鼠多巴胺(dopamine,DA)ELISA試劑盒(武漢基因美科技有限公司)，抗PI3K p85抗體(CST 貨號4257T)，抗p-PI3K p85抗體(abcam 貨號ab182651)，抗AKT抗體(CST 貨號9272S)，抗p-AKT抗體(CST 貨號4060S)，抗mTOR(Bioworld 貨號BS3611)，抗p-mTOR抗體(CST 貨號5536T)等。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組 按隨機數字表將49只大鼠隨機分為2組，分別為空白對照組(12只)、造模組(37只)。

1.5.2 DOR合并慢性心理應激大鼠模型的建立 本實驗采用慢性不可預知溫和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)聯合雷公藤多苷片法進行造模。CUMS法參照Willner[9]并加以改進[10]，包含8種不同刺激類型：禁水(24小時)、禁食(24小時)、潮濕墊料(將200mL水加入有鋸末的籠底，24小時)、傾斜(24小時)、束縛(3小時)、電擊(10 s/次×6次，每次2.5 mA)、夾尾(1分鐘)、冰水游泳(5分鐘)。每日隨機給予1種刺激。

雷公藤多苷片法從造模第15天起實施。給予雷公藤多苷片混懸液灌胃，劑量為75 mg/kg/d，連續灌胃14天，每日一次。空白對照組正常喂養，并予等量去離子水灌胃。

造模過程中，3只造模組大鼠死亡(冰水游泳死亡2只，束縛死亡1只)。

造模完成后，所有動物進行曠場試驗。隨后空白對照組隨機抽取6只、造模組隨機抽取5只處于動情間期或動情前期的大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血置于加入促凝劑的采血管；取雙側卵巢組織，置于4%甲醛溶液中固定；取海馬組織，置于凍存管內，于液氮中速凍待測。

1.5.3 給藥方法 利用隨機數字表，將造模組剩余29只大鼠隨機分為5組：模型組(5只)、西藥組(6只)、中藥低劑量組(6只)、中藥中劑量組(6只)、中藥高劑量組(6只)。空白對照組剩余6只大鼠與模型組大鼠予普通飼料正常喂養。西藥組予激素補充治療方案治療4個動情周期，第1～5天每日予戊酸雌二醇片溶液灌胃，劑量為0.105 mg/kg/d，第4～5天加用地屈孕酮片2.1 mg/kg/d。第6～10天、第11～15天、第16～20天重復第1～5天的給藥方案。中藥低、中、高劑量組分別予配制好的低、中、高濃度的中藥顆粒劑溶液灌胃。按照人常用劑量(26 g/d)為等效劑量，經等效體表面積公式[11]換算，中藥高、中、低劑量分別為：5.46 g/kg/d、2.73g /kg/d、1.365 g/kg/d。給藥治療期間，模型組及各治療組仍予CUMS。給藥完成后，進行曠場試驗，后采用上述方法麻醉、取材，固定、凍存卵巢組織，凍存海馬組織。

1.6 檢測指標

1.6.1 曠場試驗 所有大鼠分別于造模后、治療后進行。每只大鼠單獨測試。測試前至少12小時未接收外界應激。自制無蓋方形敞箱，60 cm×100 cm×100 cm，底部均分為25個小方格。將大鼠從尾根部1/3處提起，輕輕放入敞箱正中格，使其自由活動3分鐘，計算其水平穿格及垂直活動次數。測試完成后，用75%乙醇溶液清洗敞箱，防止遺留大鼠信息影響下次測試結果。

1.6.2 卵巢組織形態學觀察 經中性福爾馬林溶液固定的卵巢組織行梯度乙醇脫水，之后二甲苯透明，浸蠟，包埋成蠟塊，切成4 μm厚的切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后使用中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察、記錄并拍照。

1.6.3 海馬組織神經遞質檢測 將凍存海馬組織制備成組織勻漿，采取酶聯免疫吸附法檢測治療前后5-HT、DA水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6.4 蛋白質印跡法檢測PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達量 分別取0.1 g大鼠卵巢、海馬組織加入1 mL RIPA細胞裂解液進行組織裂解，離心后收集總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經制膠、上樣、轉膜、封閉后，分別加入相應一抗，4℃孵育過夜。于次日使用辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5小時。隨后使用ECL發光試劑盒曝光顯影，使用Image J軟件進行膠片條帶的半定量分析。

1.6.5 qRT-PCR法檢測PI3K、AKT、mTOR的mRNA含量 分別使用1μg大鼠卵巢、海馬總RNA進行逆轉錄，獲得cDNA，進行熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。以β-actin為內部參照，引物濃度為1 μmol/L，cDNA使用1 μL，反應條件按照說明書采用兩步法進行，95℃預變性1分鐘，95℃變性20秒，60℃退火延伸1分鐘，共計40個循環。反應結束后，所得CT值按照2-△△Ct方法進行均一化處理后再進行mRNA相對含量的統計學分析。內參及引物見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.7 數據處理

2 結果

2.1 行為學變化

造模后，造模組水平穿格次數和垂直活動次數均明顯小于對照組(P<0.05)。給藥20天后，模型組的活動情況仍明顯差于空白對照組，各治療組與模型組相比均有不同程度的升高；其中，中藥高劑量組在水平穿格次數上明顯高于模型組(P<0.01)。結果見表2、表3。

表2 造模后空白對照組與造模組曠場試驗情況

表3 治療后各組曠場試驗情況

2.2 卵巢組織病理變化

造模后，空白對照組可見較多大小不等各期卵泡，顆粒細胞排列有序、發育良好，卵巢見較多黃體和血管；模型組可見較多擴張的閉鎖卵泡，卵泡形態不佳，部分顆粒細胞層排列紊亂、層數減少，黃體和血管明顯減少，提示DOR造模成功，見圖1。

注：A:空白對照組；B:造模組。

治療后，空白對照組與造模后對照組表現一致；模型組仍可見較多閉鎖卵泡，以及少量黃體、血管、發育中卵泡；西藥組可見成熟卵泡，黃體及血管豐富，有部分閉鎖卵泡；中藥各組可見較多大小不等各期卵泡，顆粒細胞排列有序，見圖2。與模型組相比，治療組閉鎖卵泡數量明顯減少，同時可見較多黃體和血管；與西藥組相比，中、高劑量組可見較多初級卵泡、次級卵泡。

2.3 海馬神經遞質變化

造模后，模型組5-HT、DA水平較空白對照組明顯下降(P<0.01)。給藥后，未經治療的模型組5-HT、DA仍低于對照組(P<0.01)；而各治療組5-HT、DA水平明顯高于模型組(P<0.01)；中藥各組中，神經遞質水平隨著中藥濃度的增加而升高；其中，中藥高劑量組的5-HT水平顯著高于西藥組(P<0.01)。見表4、表5。

注：A:對照組；B:模型組；C:中藥高劑量組；D:中藥中劑量組；E:中藥低劑量組；F:西藥組。

表4 造模后對照組與模型組神經遞質濃度

表5 治療后各組神經遞質濃度

bP<0.01；與同一時期西藥組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4 PI3K/AKT/mTOR信號通路在卵巢、海馬組織中的變化情況

2.4.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路在卵巢組織中的變化情況 模型組大鼠卵巢組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達及活化均明顯低于對照組(P<0.01)。治療后各蛋白表達及活化均較模型組有所增加。其中，中藥高劑量組的AKT表達較模型組顯著改善(P<0.01)；各治療組中PI3K、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達較模型組均顯著改善(P<0.01)，且在中藥各組中，其相對表達量隨著中藥給藥濃度的增加而增加，在中藥高劑量組，其表達量均明顯高于西藥組(P<0.01)。結果見表6、表7、圖3。

表7 各組大鼠卵巢組織中AKT相對表達量M(P25-P75)

圖3 各組大鼠卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR蛋白及 其磷酸化產物免疫印跡條帶圖

表6 各組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、pAKT、mTOR相對表達量

模型組大鼠卵巢組織中PI3K mRNA、AKT mRNA和mTOR mRNA的相對含量均顯著低于對照組(P<0.01)。治療后，各指標均有所改善。其中，中藥高劑量組和西藥組中的PI3K mRNA含量顯著高于模型組(P<0.01)；各治療組中AKT mRNA、mTOR mRNA含量均顯著高于模型組(P<0.01)，且在中藥治療組中，其含量隨著中藥給藥濃度的增加而增加，在中藥高劑量組其含量均顯著高于西藥組(P<0.01)。見表8、表9。

表8 各組大鼠卵巢組織中AKT mRNA、 mTOR mRNA相對含量

表9 各組大鼠卵巢組織中PI3K mRNA 相對含量M(P25-P75)

2.4.2 PI3K/AKT/mTOR信號通路在海馬組織中的變化情況 模型組大鼠海馬組織中PI3K、AKT、mTOR蛋白表達及活化均顯著低于對照組(P<0.01)。治療后，各蛋白表達及活化情況均有所改善。其中，中藥高劑量組p-PI3K、p-AKT的表達均顯著高于模型組(P<0.01)；各治療組中PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR的表達均較模型組顯著增加(P<0.01)，且在中藥各組中，其表達量隨著中藥給藥濃度的增加而增加，在中藥高劑量組其表達均高于西藥組(P<0.01)。見表10、表11、圖4。

表11 各組大鼠海馬組織中p-PI3K、 p-AKT相對表達量M(P25-P75)

圖4 各組大鼠海馬組織中PI3K/AKT/mTOR蛋白 及其磷酸化產物免疫印跡條帶圖

模型組大鼠海馬組織中PI3K mRNA、AKT mRNA和mTOR mRNA的相對含量均顯著低于對照組(P<0.01)。治療后，各指標均有所改善。其中，在中藥高劑量組和西藥組的PI3K mRNA、AKT mRNA含量顯著高于模型組(P<0.01)；各治療組的mTOR mRNA含量均較模型組顯著改善(P<0.01)，且在中藥治療組中，其含量隨中藥給藥劑量的增加而增加，在中藥高劑量組顯著高于西藥組(P<0.01)。見表12、表13。

表10 各組大鼠海馬組織中PI3K、AKT、mTOR、mTOR相對表達量

表12 各組大鼠海馬組織中PI3K mRNA、 AKT mRNA相對含量M(P25-P75)

表13 各組大鼠海馬組織中mTOR mRNA相對含量

3 討論

3.1 DOR合并慢性心理應激大鼠模型的建立

本研究采取雷公藤多苷片聯合CUMS法造模。根據相關文獻報道，雷公藤多苷具有生殖毒性，常用于誘導卵巢功能下降的動物模型[12-14]，且模型符合中醫腎虛證特點[15-16]。CUMS法是國際通用的抑郁癥造模方法[17-18]，可造成慢性心理應激，引起類似肝郁證的行為學及交感神經遞質改變[19-20]。考慮到臨床上很多DOR患者伴有慢性心理應激狀態，本研究團隊采取二者聯合的方式誘導DOR合并慢性心理應激動物模型，以求動物模型的疾病狀態更加貼近臨床實際。

通過實驗，本研究發現雷公藤多苷片聯合CUMS能夠建立合并慢性心理應激的DOR大鼠模型，可在一定程度上反映本病的臨床特征。雷公藤多苷片誘導DOR大鼠模型在停止造模后有一定的自愈傾向，但在20天內恢復程度較小。因此，該模型可用于藥效和機制的研究。

3.2 補腎調肝方改善卵巢儲備功能、慢性心理應激狀態

補腎調肝方是筆者劉雁峰治療DOR的經驗方。本方立足于腎虛肝郁病機，以熟地黃、黃精、枸杞子溫補腎肝精血，桑寄生充養腎氣，兼以郁金解郁行氣，丹參活血通絡，鱉甲滋陰潛陽，葛根升舉清陽。本方以補益腎肝精血為基礎，又參以活血通絡、升清潛陽之品，全面調理DOR患者的氣血陰陽，使精充血足、氣血和調，從而發揮改善卵巢功能和精神情志的臨床效果。

在本次實驗中，本方體現了糾正大鼠抑郁行為的作用，該作用可能與調節海馬神經遞質含量有關；亦能夠增加DOR大鼠卵巢中的卵泡、黃體和血管，且中、高劑量組可見更多的初級卵泡、次級卵泡，提示其對卵巢儲備的改善作用可能與促進原始卵泡的生長發育有關，未來可選擇與原始卵泡發育相關的指標開展進一步的深入研究。

3.3 補腎調肝方調節DOR大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路

PI3K/AKT/mTOR信號通路主要由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)3個作用分子組成，是參與調控細胞增殖、代謝、凋亡等一系列生命現象的經典通路，與始基卵泡的募集和消耗、卵泡的發育及卵巢功能的調控關系密切[21-23]。海馬中的PI3K/AKT通路可促進血管新生、改善海馬血液循環[24]；而AKT/mTOR通路的激活、AKT和mTOR等關鍵蛋白表達的上調，可發揮抗抑郁作用[25-26]。故本研究選擇PI3K/AKT/mTOR信號通路，以探討補腎調肝方改善卵巢功能和慢性心理應激狀態的分子生物學機制。

本次實驗發現，補腎調肝方能夠在卵巢組織和海馬組織發揮調節PI3K/AKT/mTOR信號通路的作用，糾正病理狀態下通路表達、活化的抑制狀態，且該作用的實現可能與上調相應蛋白mRNA的表達有關。這一結果也提示，補腎調肝方可同時調節卵巢、海馬組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達與活化，這可能是本方同時改善卵巢功能和心理應激狀態、實現中藥腎肝同調的分子生物學基礎。

本研究初步觀察了補腎調肝方對大鼠卵巢功能及心理應激狀態的改善作用，以及對PI3K/AKT/mTOR信號通路的調節情況，發現本方能夠有效改善卵巢儲備功能和慢性心理應激狀態，其作用機制可能與上調卵巢和海馬中PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。同時也發現，購入的大鼠中存在一定數量不具正常動情周期者無法進行后續實驗。以后將進一步擴大樣本量，優化CUMS法的實施細節，細化觀測指標，開展更深入的研究。