基于HPLC指紋圖譜及多成分定量的白芍質(zhì)量評價研究

劉玨玲，趙龍山

(1.山西省中醫(yī)學校，山西 晉中 030619;2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 本溪 117004)

白芍來源于毛茛科植物芍藥，干燥根是入藥部位，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽等多種功效。《中國藥典》(2020年版)中將芍藥苷作為白芍質(zhì)量控制的指標性成分[1]，但白芍成分多種，學者陸續(xù)從中分離出揮發(fā)油、黃酮、單貼及三萜類成分[2]。鑒于白芍成分多元，故僅使用芍藥苷評價白芍藥材及飲片的質(zhì)量，無法全面考量藥材的品質(zhì)。而中藥指紋圖譜與含量測定相結合的評價方法可以從多角度評價和量化中藥材及飲片，更能反映藥材質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性、穩(wěn)定性[3,4]。

通過檢索近幾年的文獻，關于白芍指紋圖譜的研究很多，但是缺少一個能同時綜合評價白芍藥材和飲片質(zhì)量的指紋圖譜方法[1，3]。國內(nèi)外研究表明，白芍總苷主要成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷[2]。因此，本實驗將上述兩種成分做為指標成分并建立含量測定方法，為白芍的質(zhì)量控制及評價體系的建立提供依據(jù)。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

Agilent Technologies 1200 series；循環(huán)水真空泵(SHZ-Ⅲ，上海亞榮)；旋轉蒸發(fā)器(RE-52，上海亞榮)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DB，昆山超聲)。

1.2 試藥及試劑

對照品芍藥苷(Paeoniflorin，Pae)、兒茶素、苯甲酸(批號分別為110736-201842、110877-201604、00419-201703純度≥97%)購自于中檢院；芍藥內(nèi)酯苷(Albiflorin，Alb)、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯(批號為DST180419-071、DST180126-077、DST180226-063、純度≥98%)購自于成都德思特；甲醇(分析級，康科德)；甲醇、乙腈(色譜級，康科德)；無水乙醇(分析級，恒興試劑)；二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、磷酸(分析級，天津市富宇)；13批白芍藥材(S01～S13)經(jīng)山西衛(wèi)生健康職業(yè)學院楊翠玲副教授鑒定為真品，13批白芍飲片(Y01～Y13)

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液的配制 指紋圖譜對照品配制：稱取Pae、Alb、苯甲酸、兒茶素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯對照品各5 mg，置 5 mL容量瓶中，加 70% 乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的對照品溶液。含量測定對照品配制：取Pae、Alb對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含70 μg、160 μg的混合溶液。

2.1.2 供試品溶液配制 指紋圖譜樣品溶液：稱取白芍藥材或飲片的粉末約 0.2 g，置25 mL容量瓶中，加入 70% 乙醇溶解粉末，超聲提取30 min；放冷后定容，搖勻藥液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即可。

含量測定樣品溶液：取藥材粉末(Y01)約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入 50% 甲醇，超聲處理30 min，放冷，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.2 色譜條件

供指紋圖譜使用：選用ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；柱溫30℃；紫外吸收波長λ=270 nm；進樣量10 μL；流動相(A)0.1%磷酸水和(B)乙腈；1.0 mL/min的流速。梯度洗脫程序如下：0～17 min，2%B，17～27 min，10%～15%B，27～29 min，15%～17%B，29～34 min，17%B，34～37 min，17%～20% B，37～57 min，20%～30% B，57～67 min，30%～45% B。

供含量測定使用：色譜柱：ZORBAX SB-C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：(A)0.1%磷酸水和(B)乙腈；λ=230 nm；進樣量：10 μL；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min。流動相梯度洗脫程序如下：0～5 min，5%～16% B，5～10 min，16%～20% B，10～13 min，20%～30% B。

2.3 白芍指紋圖譜方法學驗證

2.3.1 精密度試驗 根據(jù)2.1.2所述方法制備白芍指紋圖譜溶液，精密吸取10 μL，連續(xù)進樣6次，計算各共有峰tR 和相對峰面積(A) RSD 分別在0.045～1.23%及0.84%～4.50%，表明儀器狀態(tài)良好，精密度結果可信度強。

2.3.2 重復性試驗 精密稱取S1 6份，按制備方法平行制得 6 份供試品溶液，進樣測定，計算得到各共有峰的tR和相對A的 RSD 分別在0.04%～0.56%和1.05%～4.78%之間，表明該色譜方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份白芍藥材指紋圖譜供試品溶液，在0、2、4、6、8、12、24 h按照色譜條件分別進樣10 μL，記錄圖譜并計算，結果為各共有峰的tR和相對A RSD分別在0.15%～1.07%，1.53%～4.95%之間，表明在0～24 h內(nèi)白芍溶液是穩(wěn)定的。

2.4 白芍藥材飲片的指紋圖譜建立

將13個批次白芍藥材及飲片制備進樣，所得的HPLC色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A)”，經(jīng)平均數(shù)模式，全譜峰匹配處理，進行圖譜擬合，生成疊加色譜圖，圖譜上共生成14個共有峰，見圖1。同時采用對照品溶液加標法進行共有峰指認，標定，見圖2。Pae峰形較好，分離度較好，色譜響應值較高，tR居中，因此選擇Pae峰為參照峰，標記為S峰，見圖2。

圖1 13批白芍藥材樣品HPLC指紋圖譜

圖2 對照特征圖譜注：峰3沒食子酸；峰5沒食子酸甲酯；峰7兒茶素；峰10芍藥內(nèi)酯苷；峰11芍藥苷；峰121,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖

2.5 白芍藥材飲片指紋圖譜相似度評價

由表1可知，各個批次白芍藥材/飲片的相似度在0.918～0.996。表明藥材及飲片相似度較好，差異較小。

2.6 Pae和Alb苷含量測定方法學

2.6.1 專屬性試驗 取一批藥材供試品溶液、50% 甲醇溶液、混合標準品溶液連續(xù)進樣結果見圖3，表明該方法專屬性良好。

2.6.2 線性范圍 稱取2.5 mg Alb、5 mg Pae于25 mL容量瓶中，混勻，配制成Alb 100 μg/mL，Pae 300 μg/mL的混合標準品溶液。精密量取混標液(0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 mL)，稀釋定容，得Alb 5～80 μg/mL，Pae 15～240 μg/mL的標準溶液，進樣，得到峰面積后計算與濃度的關系，建立標準曲線。

表1 白芍樣品相似度

2.6.3 儀器精密度試驗 將白芍供試品溶液24 h內(nèi)依法連續(xù)進樣6次，結果為Pae RSD值為1.31%、Alb RSD為1.27%。

2.6.4 日間精密度試驗 將白芍按照之前所述方法制備，24 h內(nèi)連續(xù)進樣3次，持續(xù)3天，分別記錄2種化合物的A，計算其RSD值，結果顯示日內(nèi)精密度RSD范圍1.22%～1.93%，日間精密度RSD分別為1.80%和1.41%，符合要求。

表2 Pae、Alb線性關系、檢測限和定量限結果

2.6.5 重復性試驗 取同一批Y016份，分別制備樣品溶液，連續(xù)進樣，測定2種成分的峰面積，Pae和Alb峰面積RSD值分別為1.65%和1.64%。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批白芍藥材粉末(Y01)，按上文方法制備，于0,2,4,6,8,12,24 h精密吸取10 μL，Alb和Pae RSD%值分別為0.42%和0.4%。表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.7 準確度試驗 取已有含量數(shù)據(jù)的同一批白芍樣品(n=3)，制備溶液后按照0.5∶1、1∶1、1.5∶1的比例添加2種成分對照品，進樣分析測定，計算A，Pae和Alb的回收率，RSD在0.55～2.14之間，表明方法回收率良好。

2.7 13批白芍藥材、飲片的含量分析

藥材和飲片中2類指標成分的相差不大，說明經(jīng)凈制后，飲片中有效成分變化很小。見表4。

表3 Alb和Pae的穩(wěn)定性結果

表4 26批白芍樣品中芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的百分含量

3 討論

3.1 色譜條件考察

在篩選色譜條件時，首先對考察紫外吸收波長，在270 nm時成分響應較好，故認定270 nm作為檢測波長效果較好。而在230 nm處Pae和Alb的吸收均是最強的，因此含量測定的檢測波長選擇230 nm。

3.2 提取條件考察

考察了甲醇(70%、50%)、乙醇(70%、50%)四種不同的溶劑，實驗表明50%甲醇效果最好，因此選擇50%甲醇為提取溶劑。還分別考察了提取的溶液體積、時間，最后的條件是25 mL 50%甲醇提取15 min的效果最好。

4 結論

本研究系統(tǒng)的建立了白芍藥材和飲片HPLC指紋圖方法，通過對13批白芍藥材和飲片的檢測分析，共確認14個共有峰，26批次的指紋圖譜數(shù)據(jù)的相似度為0.9，可較全面的反映白芍的化學成分信息，同時基于Pae和Alb的藥效及藥理作用，還完善了指標性成分的含量測定方法，2個方法相關的方法學驗證符合要求。方法可以更為全面、系統(tǒng)地評價白芍的質(zhì)量，為下一步白芍質(zhì)量標志物篩選提供依據(jù)。