新型苦參酸-氨基甾體化合物對人髓性白血病K562細胞增殖的抑制作用

楊瑞虹，何 群，郝志英，徐變珍，李慧芳,徐 珍

(1.山西衛生健康職業學院，山西 晉中 030619;2.中南大學湘雅醫學院,湖南 長沙 410078;3.山西省腫瘤醫院，山西 太原 030000)

苦參堿系從中藥苦參中提取分離出的生物堿，現代藥理研究表明苦參堿在保護肝臟和心腦血管、抗病毒、免疫調節等方面具有重要的臨床應用價值[1，2]。近年來大量的體內外研究證實，苦參堿能有效抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞分化，在抗腫瘤方面具有明顯功效[2，3]。研究證實氨基甾體化合物對慢性髓性白血病K562細胞具有抑制增殖和誘導分化作用[4]。利用藥物拼合原理，將苦參堿的水解產物苦參酸與氨基甾體成酯，所得產物為新化合物，目前尚未有關有該化合物的研究報道，由于合成所用的兩個化合物均具有抗腫瘤活性，有望產生協同作用，提高苦參堿的抗腫瘤活性。結合苦參堿和氨基甾體化合物的抗瘤譜，選擇人髓性白血病K562細胞株為體外試驗細胞，K562細胞系建于CML急變期的患者，是第一個人類髓性白血病人工培養的細胞，已廣泛用作研究白血病的細胞模型[3-6]。本試驗旨在研究苦參酸-氨基甾體化合物(KSS-KH)對人髓性白血病K562細胞株增值及分化的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

K562細胞由中南大學湘雅醫學院血液生理研究室提供，RPMI1640培養基(美國GIBCO公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，瓊脂(美國Sigma)，MTT試劑盒(美國Sigma)，流式細胞儀(美國Beckman公司)，多功能酶標儀(美國Thermo公司)，苦參堿(KSJ 大連美侖生物技術有限公司，批號：110805-201709)，苦參酸-氨基甾體化合物(KSS-KH 課題組自制)，氨基甾體化合物(KH 中南大學湘雅醫學院血液生理研究室提供)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 K562細胞株由中南大學湘雅醫學院血液生理研究室傳代保存，將K562細胞加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養基中，置于培養箱(37℃，5%CO2)中，飽和濕度培養。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 樣品溶液配制及實驗分組 RPMI1640培養基用無菌雙蒸水溶解，碳酸氫鈉調pH值至7.2～7.4，濾過除菌備用；KH、KSS-KH、 KSJ.KH(苦參堿和氨基甾體1∶1混合物)用二甲基亞砜(DMSO)分別配置成10-1M的儲備液，再用上述RPMI1640培養基分別稀釋成(10-4～10-8)為三個實驗組；空白對照組加入實驗組等量的RPMI1640培養基。

1.2.3 樣品對K562細胞液體培養的影響 取對數生長期細胞以每mL 5×104個加入培養體系，三個實驗組分別加入不同濃度(10-4～10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH，空白對照組加入實驗組等量的RPMI1640培養基，接種1 mL于24孔板中，每組平行接種3孔，培養5 d，用MTT計數細胞數，實驗重復3次。

1.2.4 MTT比色法測定樣品對細胞增殖抑制作用 采用96孔板培養K562細胞，使每mL含5×104個細胞；三個實驗組分別加入不同濃度(10-4～10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH，空白對照組加入實驗組等量的RPMI1640培養基，置于37℃，5%CO2培養箱中，飽和濕度培養5 d，離心、吸去上清；每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h,離心、吸去上清；每孔加入100 μL DMSO，低速震蕩10 min，使甲瓚結晶物充分溶解；用酶聯免疫檢測儀，以溶劑DMSO孔為空白，在590 nm波長下測定各孔的吸光度(OD值)，計算細胞增殖抑制率。實驗重復三次。

1.2.5 瑞氏染色觀察細胞形態 將105個K562細胞加入10 mL含10%新生牛血清的RPMI1640培養基中；實驗組分別加入不同濃度(10-4～10-8)的KSS-KH，空白組加入實驗組等量的RPMI1640培養基，置于培養箱(37℃，5%CO2)中，飽和濕度培養5 d，離心收集細胞，涂片，滴加瑞氏染液，固定細胞約1 min，再滴加等量PBS (pH值至6.4～6.8)緩沖液，使染液充分混勻，染色10 min，沖洗、涼干、鏡檢，觀察細胞形態的變化。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 對K562細胞增殖的抑制作用 KSS-KH、KH、KSJ.KH對細胞增殖的影響見表1，劑量抑制曲線見圖1。

表1 不同濃度藥物對K562細胞MTT值的影響

圖1 不同濃度藥物對K562細胞增殖抑制的影響

2.1.1 不同濃度氨基甾體化合物(KH)對K562細胞的增殖抑制作用 不同濃度KH處理K562細胞5 d后，細胞增殖抑制率隨著藥物的濃度增加而升高，各濃度抑制率具有顯著的差異性(P<0.05)，10-8M對K562細胞即有抑制作用，10-5M細胞增殖抑制率顯著提高(22.3%)，10-4M細胞增殖抑制率達到94.1%。

2.1.2 不同濃度苦參堿和氨基甾體(1∶1)混和物(KSJ.KH)對K562細胞的增殖抑制作用 不同濃度KSJ.KH處理K562細胞5 d后，細胞增殖抑制率隨著藥物的濃度增加而升高，各濃度抑制率具有顯著的差異性(P<0.05)，10-4M對細胞增殖抑制作用與單獨使用KH接近，說明苦參堿和氨基甾體聯合使用，僅具有相加作用，但不呈現協同作用。

2.1.3 不同濃度苦參酸氨基甾體化合物(KSS-KH)對K562細胞的增殖抑制作用 不同濃度KSS-KH處理K562細胞5 d后，結果顯示10-8～10-6M與對照組無顯著差異(P>0.05)，10-8M對K562細胞無抑制作用，10-7～10-5M細胞增殖抑制率均低于單獨使用KH及苦參堿和氨基甾體混和物(KSJ.KH)，但10-4M對細胞增殖的抑制作用顯著提高(98.8%)，與其他各濃度抑制率具有顯著差異性(P<0.05)，說明KSS-KH在較高濃度下對K562細胞具有較強的抑制作用。

2.1.4 比較相同藥物濃度下，不同實驗組之間的差異 在10-8～10-5M 各實驗組間對細胞的抑制率有顯著差異(P<0.05)；10-4M濃度下KH和KSJ.KH之間無顯著差異，但KSS-KH與KH、KSJ.KH組間有顯著差異(P<0.05)，說明在較高濃度下苦參酸氨基甾體化合物(KSS-KH)對K562細胞增殖的抑制率明顯強于其他兩組。

2.2 瑞氏染色觀察細胞形態

K562細胞經處理，采用瑞氏染色，觀察細胞形態。對照組未經藥物處理，K562細胞呈圓形或橢圓形，細胞核和胞漿無明顯界線，細胞漿呈藍紫色；實驗組經KSS-KH(10-6M)處理后，細胞體積增大、細胞染色質變淺，細胞核漿比變小，呈現分化特征見圖2。

圖2 K562細胞形態對比(A.未經藥物處理的細胞;B.經10-6 KSS-KH處理的細胞)

3 討論

慢性髓性白血病(CML)又稱為慢性粒細胞白血病，是造血干細胞惡性克隆性疾病，以髓系細胞惡性增殖為特點，K562細胞系研究慢性髓性白血病的細胞模型。本試驗將目標化合物苦參酸-氨基甾體(KSS-KH)與氨基甾體(KH)、苦參堿氨基甾體混合物(KSJ.KH)對K562細胞抑制作用進行比較，結果發現將苦參酸-氨基甾體化合物對K562具有較強的抑制作用，說明將苦參堿水解，與氨基甾體形成酯，兩種藥物可能會產生協同作用；

形態學觀察K562細胞經KSS-KH處理后，細胞體積變大，呈現分化特征，提示KSS-KH可能會通過誘導K562細胞分化而發揮作用，但作用機制有待進一步研究；苦參酸-氨基甾體化合物(KSS-KH)是利用苦參堿為原料進行深度開發，充分利用我國獨特的中藥生態資源，發揮中醫藥在防治疑難病癥中的作用。目前慢性髓性白血病(CML)主要采用化學藥物和骨髓移植治療，骨髓移植受供體來源等限制難以廣泛使用，化學藥物治療中藥物對人體正常細胞會產生較大的毒性，而本課題利用苦參堿合成的新型化合物，可發揮天然產物毒性較低的優勢，使其更安全有效地用于臨床，具有進一步研究開發的價值。