穿山龍多糖的提取及其體外抗氧化活性研究

朱夢堯，旁赟寧，譚景全，呂 沖，陳祥娥

（濟寧醫學院 生物科學學院，山東 日照 276826）

穿山龍，薯蕷科，又名黃姜，大部分分布于海拔較高的地方，生長溫度以15～25 ℃最佳[1]。穿山龍具有活血舒筋、止咳平喘、消食利水、止痛等功效；民間多用于浸酒或煎服，可用于慢性支氣管炎、筋骨疼痛、風濕性關節炎等癥的治療。現代藥理研究表明，穿山龍具有調節免疫、改善心血管、祛痰、抗腫瘤、抗炎鎮痛等多種藥理作用，應用前景十分廣闊[2-7]。目前對穿山龍藥用成分的研究以皂苷為主，對多糖研究較少[8-10]。中藥多糖類成分具有顯著的降血糖、抗氧化、調節機體免疫功能等作用，是當前研究熱點之一[11-14]。為加強穿山龍藥材的綜合應用，本試驗采用水提醇沉法提取穿山龍多糖，考察料液比、水浴溫度和提取時間的影響，并進行正交試驗優化。對所得穿山龍多糖的體外抗氧化活性進行考察，為穿山龍多糖的標準化提取和藥材的綜合開發利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

752N紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；TDL-60B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-1數顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；BS110型電子天平（德國賽多利斯）；X3R離心機（美國賽默飛世爾）；DHG-9030A干燥器（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 樣品與試劑

穿山龍藥材由中藥學教研室提供并鑒定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma），葡萄糖對照品，無水乙醇，抗壞血酸（Vc），濃硫酸，苯酚，氫氧化鈉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，鄰苯三酚，三氯化鐵，鐵氰化鉀等均為分析純。

2 方法

2.1 穿山龍多糖提取工藝

取干燥的穿山龍根莖，粉碎過80目篩。取一定量的藥粉按相應的提取條件浸漬提取2次，合并提取液，濃縮后醇沉，所得沉淀復溶后經進一步純化干燥獲得干浸膏。分別研究料液比、水浴溫度及提取時間等因素水平變化對所得多糖的影響，以此為依據進行正交試驗優化。

2.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。取葡萄糖對照品10 mg，溶解后加蒸餾水定容于100 ml量瓶中，得葡萄糖對照品溶液。選取8只試管，分別加入0.1～0.8 ml葡萄糖對照品溶液，加水稀釋到1.0 ml。分別加入6 %苯酚溶液0.5 ml及濃硫酸2.5 ml，混勻后靜置20 min。另取一只試管作為對照，加入蒸餾水1.0 ml和上述相應體積的苯酚、濃硫酸，490 nm處測定吸光度（A490）值，以A490為縱坐標（y），以葡萄糖濃度為橫坐標（x，μg/ml），繪制標準曲線。

2.3 穿山龍多糖提取的單因素實驗

2.3.1 料液比的影響 分別稱取20 g穿山龍藥粉，固定提取溫度為90 ℃，提取時間為3 h，考察料液比分別為1:6，1:10，1:14，1:18條件下，所得穿山龍多糖的含量。

2.3.2 水浴溫度的影響 分別稱取20 g穿山龍藥粉，固定料液比為1:10，提取時間為3 h，考察提取溫度分別為60，70，80，90 ℃條件下，所得穿山龍多糖的含量。

2.3.3 提取時間的影響 分別稱取20 g穿山龍藥粉，固定料液比為1:10，提取溫度為90 ℃，考察提取時間分別為2，3，4，5 h條件下，所得穿山龍多糖的含量。

2.4 正交試驗設計

在單因素實驗基礎上進行正交試驗，對料液比、水浴溫度、提取時間進行三因素兩水平的實驗并分析，正交試驗設計參數及水平見表1。

表1 正交試驗參數及水平

2.5 穿山龍多糖體外抗氧化性研究[15]

其中，ΔAx為樣品的自氧化速率；ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率。

2.5.2 總還原能力實驗 將所得穿山龍多糖加水配制成濃度分別為0.1，0.5，1，2，5，10，15 mg/ml的樣品溶液。分別取0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.6）和1 %鐵氰化鉀溶液各2.5 ml，混勻后分別加入不同濃度的樣品溶液各1 ml，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，并依次加入蒸餾水2.0 ml，0.1 % FeCl32.0 ml，混勻，室溫靜置10 min后，測定700 nm處吸光度（A700），以Vc為陽性對照[9]，每組平行測定3次。

2.5.3 DPPH?清除能力實驗 將所得穿山龍多糖加水配制成濃度分別為0.1，0.5，1，2，5，10，15 mg/ml的樣品溶液。取5 ml樣品溶液，置于試管中，分別加入0.2 mmol/L DPPH?乙醇溶液1 ml，混勻，室溫下避光放置30 min，以乙醇溶液為空白對照，測定517 nm處吸光度（A517），Vc為陽性對照，每組平行測定3次。

DPPH?自由基清除率（%）=[1-（Ax-Ac）/A0]×100 %

其中：Ax為樣品吸光度；A0為空白組吸光度；Ac為樣品本底吸光度。

2.6 數據處理

3 結果

3.1 葡萄糖標準曲線

按2.2項所述硫酸-苯酚法，得葡萄糖測定標準曲線回歸方程為y=0.012x-0.007，R2=0.992。由標準曲線可知葡萄糖濃度與A490之間線性關系良好，可用于多糖含量的測定。

3.2 單因素實驗結果

3.2.1 料液比對穿山龍多糖提取率的影響 料液比對穿山龍多糖提取率的影響見圖1。由圖1可見，隨著料液比的增加，多糖提取率呈上升趨勢，當料液比高于1:10后，提取率增加不明顯，估計此時組織中多糖溶出已近飽和，為節約成本，確定適宜料液比為1:10。

圖1 料液比對穿山龍多糖提取率的影響

3.2.2 水浴溫度對穿山龍多糖提取率的影響 水浴溫度對穿山龍多糖提取率的影響見圖2。由圖2可見，隨著溫度的增加，多糖提取率明顯上升，當溫度達到90 ℃左右，提取率仍有增加趨勢，變動不大，因此將提取適宜溫度選定為90 ℃。

圖2 水浴溫度對穿山龍多糖提取率的影響

3.2.3 提取時間對穿山龍多糖提取率的影響 提取時間對穿山龍多糖提取率的影響見圖3。由圖3可見，隨著時間的延長，多糖提取率基本呈上升趨勢，考慮提取效率和效果，提取時間以4 h左右為好。

圖3 提取時間對穿山龍多糖提取率的影響

3.3 正交試驗

根據單因素實驗結果，進行三因素兩水平的正交試驗優化，結果見表2。由表2可見，對穿山龍多糖提取率影響最大的因素為提取時間，其次是水浴溫度，影響較小的是料液比。綜合以上分析結果，并考慮實際生產過程中的需要，確定最佳提取工藝為：料液比1:10，水浴溫度90 ℃，提取時間4 h。此條件下所得粗多糖提取率為2.72 %。

表2 正交試驗結果

3.4 穿山龍多糖的抗氧化活性

圖4 穿山龍多糖（A）與Vc（B）的清除能力

3.4.2 總還原能力測定 總還原能力試驗中，抗氧化劑可作為電子供體將鐵氰化鉀的Fe3+還原成Fe2+，形成亞鐵氰化鉀，后者進一步與FeCl3反應，生成在700 nm下有強吸收的普魯士藍，抗氧化劑的還原能力越強，A700越高。穿山龍多糖總還原能力結果見圖5，結果表明隨著多糖濃度逐漸升高，A700上升，當濃度大于3 mg/ml后，吸光度趨于平穩（約0.249±0.001）。實驗測得Vc濃度在0.1～0.5 mmol/L范圍內與A700線性關系良好，所得穿山龍多糖的總還原力最大值約相當于（0.338±0.006）mmol/L Vc的還原力。

圖5 穿山龍多糖（A）與Vc（B）總還原能力

3.4.3 DPPH?清除能力 DPPH?為一種性質較為穩定的自由基，抗氧化性物質能提供電子，滅活DPPH?同時削弱其A517。穿山龍多糖DPPH?清除能力見圖6，隨著多糖濃縮的升高DPPH?清除率逐漸上升。當濃度大于5 mg/ml時，清除率趨于平穩，最大值為85.63 %±0.43 %（15 mg/ml）。在0.12～0.60 mmol/L范圍內Vc的DPPH?清除率與濃度呈線性關系，所得穿山龍多糖的DPPH?清除能力最大值約相當于（0.520±0.015）mmol/L Vc的清除能力。

圖6 穿山龍多糖（A）與Vc（B）對DPPH?清除能力

4 小結與討論

穿山龍具有免疫調節、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗突變等作用[16]。本實驗考察了穿山龍多糖水醇法提取工藝的關鍵因素，并進行了正交試驗優化，確定關鍵因素中，對多糖提取率影響最大的是提取時間，其次為水浴溫度，而料液比的影響較小。確定最佳工藝為料液比1:10，水浴溫度90 ℃，提取時間4 h，多糖提取率為2.72 %。所得多糖經進一步純化后進行了體外抗氧化性研究，實驗發現穿山龍多糖對及DPPH?均表現出良好的清除能力，對Fe3+也具有較好的還原力，具有開發為抗氧化劑的潛能，其抗氧化作用具有一定的劑量依賴性。本實驗為穿山龍多糖的標準化提取和藥材的綜合開發利用提供了一定的研究基礎和參考。