HPLC測定天麻祛風補片中天麻素、哈巴苷和梓醇的含量

杜健磊, 張彥旭,王俊蘋

（1.駐馬店市中心醫院 藥學部，河南 駐馬店 463000；2.駐馬店市第二人民醫院 藥學部，河南 駐馬店 463000）

天麻祛風補片具有溫腎養肝、祛風止痛等功效，臨床常用于治療肝腎虧損、風濕入絡所致的痹病，如頭暈耳鳴、關節疼痛、腰膝痠軟、畏寒肢冷、手足麻木等癥的治療[1-4]。該品種系由天麻、地黃、當歸、羌活、獨活、附片、肉桂、杜仲、川牛膝、玄參等11味藥材加工制成，方中天麻為君藥，具有息風止痙，平抑肝陽，祛風通絡之功效[5-8]，地黃為臣藥，具有淸熱涼血，養陰生津之功效[9-12]，玄參為佐藥，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結之功效[13-16]。該品種現收載于2015版《中國藥典》中，標準中含量測定項為天麻素，僅針對君藥天麻進行質量控制[17]。為保障人民群眾的用藥安全，本研究建立天麻祛風補片中天麻素、哈巴苷和梓醇含量測定的高效液相色譜（HPLC）分析方法?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-2010 AHT型高效液相色譜儀（在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、LC-Solution工作站，島津科技有限公司）；Sartorius Quintix513-1CN型萬分之一電子天平（賽多利斯科技有限公司）；Fuyang F-040S型小型超聲儀（容積：10 L，蘇州邁弘電器有限公司）。

1.2 試藥

天麻素對照品（批號：110807-201809，含量以96.7 %計）；哈巴苷對照品（批號：111729-201707，含量以96.8 %計）；梓醇對照品（批號：110808-201711，含量以99.6 %計），均購于中國食品藥品檢定研究院；天麻祛風補片（昆明中藥廠有限公司，規格：糖衣片，片心重0.35 g，批號：191012，191223，200116）；甲醇、乙腈均為色譜純，實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Spherisorb ODS-1 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，1 % A；8～13 min，1 %A～12 % A；13～24 min，12 %A～48 % A；24～28 min，48 %A～82 %A；28～31 min，82 %A～1 % A；31～36 min，1 % A）；檢測波長：216 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取梓醇對照品、天麻素對照品和哈巴苷對照品適量，精密稱定，置50 ml量瓶中，加80 %甲醇制成每1 ml含梓醇0.996 mg、天麻素0.484 mg和哈巴苷0.581 mg的對照品儲備溶液；再精密量取2.5 ml，置25 ml量瓶中，加80 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取天麻祛風補片（批號：191012）20片，除去包衣，精密稱定，研細，取約2.0 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加80 %甲醇約30 ml，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）25 min，取出放冷至室溫，加80 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按天麻祛風補片處方比例及制備工藝，制備缺地黃、天麻和玄參的陰性對照樣品，陰性對照樣品按供試品溶液制備方法處理，制得陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。結果發現供試品溶液色譜圖中梓醇、天麻素和哈巴苷色譜峰保留時間與對照品溶液一致，且3種活性成分分離良好，陰性對照溶液色譜圖無干擾峰存在，表明方法專屬性良好。見圖1

圖1 典型色譜圖

2.3.2 精密度考察 取2.2.1項下對照品溶液，按2.1項下色譜條件，重復進樣6次，每次進樣10 μl，采集色譜圖，依據6次進樣所得色譜圖中梓醇、天麻素和哈巴苷峰面積計算RSD。結果梓醇峰面積RSD為1.12 %，天麻素峰面積RSD為0.91 %，哈巴苷峰面積RSD為0.78 %，表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性關系考察 精密吸取2.2.1項下對照品儲備溶液適量，加80 %甲醇制備含梓醇、天麻素和哈巴苷系列標準曲線溶液，上述溶液分別精密吸取10μl，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。分別以梓醇、天麻素和哈巴苷峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，計算曲線方程。結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.3.4 重復性試驗 取同一批號天麻祛風補片（批號：191012）共6份，按2.2.2項下制備供試品溶液，分別精密吸取上述溶液各10 μl，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。分別計算梓醇、天麻素和哈巴苷含量，以6次含量測定結果計算RSD。結果梓醇、天麻素和哈巴苷平均含量分別為0.4167，0.1936，0.5021 mg/片；重復性RSD分別為2.01 %，2.37 %，1.63 %，表明方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取2.3.4項下供試品溶液，于室溫下分別放置0，2，4，6，9，12，24 h，各精密吸取10 μl，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。結果梓醇峰面積的RSD為1.72 %，天麻素峰面積RSD為2.11 %，哈巴苷峰面積RSD為1.16 %，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已測定梓醇、天麻素和哈巴苷含量的天麻祛風補片（批號：191012）共6份，每份約2.0 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，精密加入2.2.1項下對照品儲備溶液適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液；分別精密吸取上述溶液各10 μl，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖；計算梓醇、天麻素和哈巴苷的加標回收率。見表2。

表2 加標回收試驗結果

2.4 樣品測定

取天麻祛風補片（昆明中藥廠有限公司，批號：191012，191223，200116），分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取上述溶液各10 μl，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖，計算樣品中梓醇、天麻素和哈巴苷的含量。見表3。

表3 含量測定結果

3 討論

3.1 活性成分的選擇

天麻祛風補片是由天麻、地黃、玄參、當歸、羌活等11味藥材經打粉、混合、煎煮等工序加工制成的中藥片劑，現行標準中以天麻藥材中天麻素為含量測定項，不能較全面地體現該產品的質量水平。本文選擇藥材組成中君藥天麻、臣藥地黃、佐藥玄參，與其相對應的活性成分為天麻素、梓醇、哈巴苷，采用HPLC同時檢測3種活性成分的含量，能更為全面地體現該品種的質量水平。

3.2 檢測波長的選擇

取2.2.1項下對照品溶液，精密吸取10 μl，按2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，設置光譜采集波長在200～400 nm范圍，采集光譜圖（見圖2）。由光譜圖可見，梓醇在210 nm、天麻素在219 nm、哈巴苷在210 nm處有最大吸收，綜合3種活性成分的紫外響應，最終確定216 nm作為檢測波長。

圖2 3種成分紫外光譜圖

3.3 提取方法的優化

分別選擇甲醇、90 %甲醇、80 %甲醇和70 %甲醇作為提取溶劑，考察溶劑對提取效果的影響。結果選擇80 %甲醇作為提取劑時，提取效果最佳；再分別考察超聲功率和提取時間的影響，最終確定最佳提取條件為：80 %甲醇作為提取溶劑，超聲功率250 W，時間25 min。

綜上，本文建立天麻祛風補片中天麻素、哈巴苷和梓醇活性成分含量測定的HPLC分析方法，該方法具有簡單、準確、重復性好等優點，可作為天麻祛風補片的定量檢測方法，為進一步完善和提高該品種的質量標準奠定了基礎。