不同基原大黃藥材的HPLC指紋圖譜及含量差異研究

袁振海，王 芳，梁大連，賈嬋媛，陳彬合

（山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatunL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumoffocinaleBaill.的干燥根和根莖。苦，寒。歸脾、胃、大腸、肝、心包經。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經，利濕退黃的功效。臨床用于實熱積滯便秘，血熱吐衄，目赤咽腫，癰腫疔瘡，腸癰腹痛，瘀血經閉，產后瘀阻，跌打損傷，濕熱痢疾，黃疽尿赤，淋證，水腫；外治燒燙傷等[1]。

大黃是中國傳統四大中藥之一，含蒽衍生物類、鞣質類、二苯乙烯類、萘衍生物類等多種有效成分，具有廣泛的藥理作用[2]。僅中國藥典（2020年版）一部中收錄的含大黃的復方制劑即有數十種，如一清顆粒、一捻金、十一味能消丸、小兒熱速清口服液、止血復脈合劑、烏軍治膽片等。但由于目前市場上中藥飲片質量參差不齊、煎煮工藝各異，缺乏行之有效的質量評價與監督體系。加之大黃為3種基原，不同基原藥材的使用目前未有明確的指導原則，也鮮有關于不同基原藥材質量差異的研究報道。本文希望通過初步的對比分析研究，為此類藥材的研究提供一定的參考，并為提高中藥材質量控制水平乃至減小中藥品種臨床差異、提高療效提供一定的依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（Waters e2695泵，Waters 2998 PDA檢測器，Waters四元在線脫氣機，Empower色譜工作站，美國Waters公司）；XA105DU電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

蘆薈大黃素對照品（110795-201609），大黃素對照品（110756-201512），大黃酸對照品（110757-201607），大黃素甲醚對照品（110758-201616），大黃酚對照品（110796-200309），大黃對照藥材（藥用大黃，120984-201202，編號：S1），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（天津賽孚瑞科技有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

本文研究中使用的不同基原及產地的大黃藥材來源見表1。

表1 大黃藥材來源

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch PG-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A相為0.1 %磷酸水溶液，B相為乙腈，梯度洗脫（見表2）；流速1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取蘆薈大黃素對照品、大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素甲醚對照品及大黃酚對照品適量，加甲醇制成每l ml含蘆薈大黃素20 μg、大黃酸20 μg、大黃素20 μg、大黃酚10 μg、大黃素甲醚10 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過四號篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3 指紋圖譜的考察[3-4]

3.1 精密度試驗

精密稱取編號S2（產地：四川）的大黃樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續進樣6 次，測得各峰的保留時間RSD＜2.94 %，各峰峰面積RSD＜3.87 %，表明該法精密度良好。

3.2 重復性試驗

精密稱取S2（產地：四川）的大黃樣品6份，按2.3項下方法制備供試液，按2.1項下色譜條件測定，選取分離度較好的14個共有峰進行比較，結果顯示，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜4 %，表明該法重復性良好。

3.3 穩定性試驗

取3.1項下供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h進樣測定，結果顯示，14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜4 %，表明供試品溶液在12 h內穩定。

3.4 各批次大黃藥材的HPLC分析[5-8]

分別按2.1項下條件測定對照品溶液和7個批次大黃藥材的供試品溶液，記錄色譜圖。將S1～S7 7批大黃藥材HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”軟件，利用中位數法，以S1批樣品的HPLC 圖為參照圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，建立大黃藥材的HPLC 指紋圖譜共有模式圖，見圖1（P2）。混合對照圖譜見圖1（P1）。

圖1 大黃對照品圖譜（P1）及藥材的指紋圖譜共有模式圖（P2）

采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，進行相似度計算，得到7批大黃藥材的共有指紋圖譜R，結果見圖2。由圖2可見，指紋圖譜共有14個主要共有峰。

圖2 7批大黃藥材的HPLC指紋圖譜

3.5 大黃指紋圖譜相似度評價

以大黃藥材的共有模式指紋圖譜（R）為標準，進行整體相似度評價，結果見表3。

表3 不同批次大黃藥材相似度評價結果

由表3可見，7個批次大黃樣品共同評價時，各批次間的相似度有明顯差異，其中S3、S4、S5 3批藥用大黃相似度＜0.9，S1（藥用大黃）、S2（藥用大黃）、S6（唐古特大黃）、S7（掌葉大黃）4批相似度＞0.95，表明上述產地、批次的大黃藥材整體概貌及主要成分種類差異較大，但3種基原的大黃通過相似度比較未體現出明顯差異。

3.6 藥用大黃藥材的HPLC分析

由圖2可見，唐古特大黃（S6）和掌葉大黃（S7）共有峰明顯多于藥用大黃（S1～S5），尤其在保留時間3～28 min之間最為明顯，因此單獨將5批藥用大黃HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”軟件，利用中位數法，以S1批樣品的HPLC 圖譜為參照圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，進行相似度計算，建立藥用大黃藥材的HPLC 指紋圖譜共有模式圖R，結果見圖3，指紋圖譜共計16個共有峰。

圖3 5批藥用大黃藥材的HPLC指紋圖譜

3.7 藥用大黃指紋圖譜相似度評價

以藥用大黃藥材的共有模式指紋圖譜為標準，進行整體相似度評價，結果見表4。

表4 5批次藥用大黃藥材相似度評價結果

由表4可見，5個批次的藥用大黃單獨評價與上述7批藥材（3種基原）共同評價時有明顯差異。其中S3、S4相似度雖仍＜0.9，但相似度由0.6升高至0.8，而S5由0.86升高至0.96，符合相似度要求；可見藥用大黃之間整體概貌及主要成分種類雖存在一定差異，但同基原藥材間相似度評價差異小于多基原。

3.8 3種基原大黃的指紋圖譜

將唐古特大黃、掌葉大黃的HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”軟件，利用中位數法，以唐古特大黃樣品的HPLC圖譜為參照圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，進行相似度計算，建立藥材的HPLC 指紋圖譜共有模式圖P3，共有峰基本相同，兩批間相似度達0.999。比較唐古特大黃、掌葉大黃和藥用大黃的HPLC 指紋圖譜共有模式圖（P3），見圖4。

圖4 藥用大黃共有圖譜（P3）與掌葉大黃、唐古特大黃指紋圖譜

由圖4可見，藥用大黃共有峰數量及各峰面積都明顯少于唐古特大黃和掌葉大黃，但共同進行相似度評價時未能體現出不同基原間的差異，因此又以游離蒽醌和總蒽醌含量為指標，采用該指紋圖譜條件對3種基原的大黃進行進一步的分析研究。

4 不同基原大黃中蒽醌類化合物的研究

4.1 色譜條件

色譜柱：Welch PG-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A相為0.1 %磷酸水溶液，B相為乙腈，梯度洗脫（見表5）；流速1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μl。

表5 梯度洗脫程序

4.2 對照品溶液的配制

精密稱取蘆薈大黃素對照品、大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素甲醚對照品及大黃酚對照品適量，加甲醇制成每l ml含蘆薈大黃素20 μg、大黃酸20 μg、大黃素20 μg、大黃酚10 μg、大黃素甲醚10 μg的混合溶液，即得。

4.2.1 游離蒽醌供試品溶液的制備 取藥材粉末（過四號篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

4.2.2 總蒽醌供試品溶液的制備 取藥材粉末（過四號篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5.0 ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8 %鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，加熱回流1 h，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

4.3 結果及分析

根據中國藥典（2020年版）一部，大黃項下要求游離蒽醌不得少于0.20 %，總蒽醌不得少1.5 %。3種基原大黃藥材中游離蒽醌含量測定結果見表6，3種基原大黃藥材中總蒽醌的含量測定結果表7，3種基原大黃藥材的總蒽醌與游離蒽醌HPLC色譜圖見圖5。研究結果表明3種大黃均符合藥典要求，但三者各成分含量及HPLC色譜峰差異明顯。

由表6可見，在游離蒽醌的含量測定中，已知的5種成分含量在藥用大黃中由高到低依次為大黃酚＞大黃素甲醚、大黃酸＞大黃素＞蘆薈大黃素；在唐古特大黃和掌葉大黃中的含量由高到低依次為大黃素甲醚、大黃素＞大黃酸、大黃酚＞蘆薈大黃素。藥用大黃中大黃酚含量最高，約為唐古特大黃和掌葉大黃的兩倍；而唐古特大黃和掌葉大黃中大黃素和大黃素甲醚含量最高，約為藥用大黃的兩倍。

表6 3種基原大黃藥材中游離蒽醌含量結果

由表7可見，在酸化后總蒽醌的含量測定中，已知的5種成分含量在藥用大黃中由高到低依次為大黃酚＞大黃素、大黃酸＞大黃素甲醚＞蘆薈大黃素；在唐古特大黃和掌葉大黃中的含量由高到低依次為大黃素＞大黃素甲醚＞大黃酸＞大黃酚＞蘆薈大黃素。5種已知成分的含量及排序與測定游離蒽醌時發生顯著變化，其中唐古特大黃和掌葉大黃中5種已知成分的含量比酸化前測定升高10多倍，含量排序雖有變化但總體趨勢與酸化處理前接近。

表7 3種基原大黃藥材中總蒽醌的含量結果

由圖5可見，測定游離蒽醌的色譜圖中，唐古特大黃和掌葉大黃在0～35 min間出峰數量及峰1～峰17各峰面積明顯高于藥用大黃，且藥用大黃中無峰15。酸化處理后，測定總蒽醌的色譜圖中，可見色譜峰發生明顯變化，即供試品中成分發生明顯變化，經酸化處理后，未知峰2和已知5種成分的峰面積明顯升高，而其他未知峰的峰面積明顯降低甚至消失，總成分數量減少，剩余少量成分含量升高，說明大黃供試品的酸化處理改變了藥材中的原物質基礎。

圖5 3種基原大黃藥材的供試品色譜圖

5 討論

5.1 色譜條件的選擇

分別考察了為島津Inertsustain C18、Welch PGC18、Welch XB-C18、Agilent Zorbax C184種色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以及乙腈-0.1 %磷酸水溶液、乙腈-0.05 %磷酸水溶液、甲醇-0.1 %磷酸水溶液等多種流動相體系，并對柱溫、流速及進樣量進行考察，結果以乙腈-0.1 %磷酸水溶液、流速1.0 ml/min、柱溫35 ℃、進樣量10 μl的色譜條件測定時，基線較穩定，出峰較多、分離最好、峰形最佳、保留時間適宜。

5.2 指紋圖譜相似度評價

由本文研究可見，在采用指紋圖譜相似度評價大黃藥材時，不同基原藥材多批次共同評價與同基原藥材多批次評價的結果會有明顯差異，有時不能完全體現批間差異。因此在涉及多基原藥材時應尤其關注類似問題，建議在采用相似度評價的基礎上，還應根據情況增加主要色譜峰單位質量峰面積（A/W）的波動范圍，共有峰個數、非共有峰個數及峰面積總和、指紋圖譜峰形特征等指標，并運用統計方法進行適當的主成分分析和聚類分析，從而對不同基原和批次的藥材進行更全面的評價。

5.3 測定方法及成分含量控制

藥典中收錄的大黃流浸膏、浸膏及各成方制劑均以鹽酸或硫酸酸化方法制備供試品，然后以測得的大黃素和大黃酚兩者的總和或以本文中涉及的5種成分（蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚）的總和來作為質量控制的指標。根據本文研究，酸化制備的供試品的測定結果不能真實反映產品中大黃的各成分含量及各成分比例。特別是對于大黃流浸膏和大黃浸膏，采用不同基原或混合基原提取的浸膏按此方法檢測均可符合質量要求，但其中各成分實際含量及比例差異較大，推測甚至可能在一定程度下導致藥效不同。因此，建議今后可對大黃流浸膏及浸膏采用非酸化方式制備供試品，并輔以指紋圖譜進行質量控制。而對于含大黃的成方制劑，因為不同品種涉及不同藥材，乃至不同提取工藝等，成分更加復雜，根據本文初步研究結果推測，采用酸化制備供試品測定總蒽醌的方法進行質控，更難真實反映各品種在生產過程中從藥材到中間體及成品的質量傳遞，無法有效監控批間質量波動。建議應在注重此問題的前提下，結合不同產品的具體生產情況及藥效成分，盡量采用可真實反映產品中物質基礎的測定方法進行質控。

5.4 局限及完善措施

由于本試驗中收集的大黃藥材批次較少，尤其是唐古特大黃及掌葉大黃僅各一批，代表性不足，所得數據不能全面完善地反映不同基原的大黃藥材情況，但本研究內容已可為大黃的研究、使用甚至其他多基原藥材的研究、使用提供一定的基礎和參考。后續將對更多批次不同基原的大黃藥材進行研究比較，證明并完善該研究結果，為進一步提高中藥材及中藥品種的質量提供參考依據。

6 結論

綜合本文研究結果可見，不同基原的大黃藥材中成分及含量存在明顯差異，單純采用指紋圖譜相似度評價，無法有效評價其內在差異。因此在對多基原藥材評價時建議在采用指紋圖譜相似度評價的基礎上，還需增加主要色譜峰單位質量峰面積（A/W）的波動范圍，共有峰個數、非共有峰個數及峰面積總和等指標，并運用統計方法進行適當的主成分分析和聚類分析，來全面評價多基原藥材的批間差異。對于多基原藥材在實際應用時應盡量固定藥材基原，并輔助指紋圖譜進行質量控制；同基原混批使用時為保證產品質量，也應進行均一化研究，以保證產品批間質量波動較小。對于難以固定為一個基原的藥材，建議先分別進行同基原均一化研究之后，再根據工藝需求確定不同基原間的配用比例。

此外，針對大黃在酸性條件下處理后，成分發生明顯變化，不同基原間成分差異減小的情況，應注意在提取或質量控制中采用不同的制備方法可能得到不同的結果，考慮結果是否能真實表達藥材或制劑的內在質量。