體外微核試驗在一次性使用結扎夾遺傳毒性評價中的應用

王鸞鸞，孫曉霞，王國偉，孫令驍，車國喜，劉香東，劉成虎

（山東省醫療器械產品質量檢驗中心，國家藥品監督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室，國家藥品監督管理局藥品包裝材料質量控制重點實驗室，山東省醫療器械生物學評價重點實驗室，山東 濟南 250101）

遺傳毒性試驗主要通過檢測兩類主要遺傳損傷：基因突變（點突變）和染色體損傷（結構畸變等），來確定醫療器械（材料）或其浸提液等物理、化學和生物因素產生遺傳物質損傷并導致遺傳性狀改變的能力。體外微核試驗以微核作為遺傳毒性檢測終點，可用于染色體斷裂劑和非整倍體誘導劑的檢測，檢測終點明確，且方法簡便、易于開展，在食品、醫藥產業等領域遺傳損傷的早期評價中得到廣泛應用。本文根據GB/T 16886.12-2017中樣品制備方法，采用雙介質制備一次性使用結扎夾的供試品溶液，同時采用細胞分裂阻滯法和流式細胞術法評價一次性使用結扎夾的遺傳毒性，對流式細胞術法和細胞分裂阻滯法的結果進行比較，為流式細胞術在遺傳毒性體外微核檢測標準化的建立，提供可靠的依據。

1 儀器和材料

1.1 儀器

BSA822電子天平（Sartorius）；ZQZYCF振蕩培養箱（上海知楚）；DP73正置顯微鏡（Olympus）；3-18KS臺式高速分冷凍離心機（Sigma）；CytoFLEX流式細胞儀（Beckman）。

1.2 材料

某公司生產的一次性結扎夾（批號1810020）；In Vitro MicroFlow Plus Kit（BD公司）；RPMI培養基（Hyclone）；新生牛血清（浙江天杭）；胰酶（Hyclone）；雙抗（Hyclone）；環磷酰胺（CP，Sigma）；絲裂霉素C（MMC，Sigma）；胞漿阻斷劑（CytoB，Sigma）；甲醇（分析純，國藥集團）；冰醋酸（分析純，國藥集團）；姬姆薩染液（Sigma）。

1.3 細胞

中國倉鼠肺（CHL）細胞，購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。培養于含10 %新生牛血清的RPMI培養基，5% CO2、37 ℃細胞培養箱培養。試驗用細胞均處于對數生長期。

1.4 代謝活化系統

哺乳動物微粒體酶（S9）購自Moltox分子毒理學股份有限公司，與輔助因子混合后使用，S9的終濃度為10 %，臨用前配制。

2 方法

2.1 供試品溶液制備[1]

按GB/T16886.12-2017的規定，按4 g/20 ml的比例，將一次性使用結扎夾分別置于0.9 %氯化鈉注射液（SC）和含血清細胞培養基中，于（37±1） ℃、60 r/min振蕩浸提（72±2）h，制備供試品溶液。介質對照為不含供試品的SC和含血清細胞培養基，同法制備。陽性對照為0.6 μg/ml MMC（無活化代謝系統短期接觸，-S9/6 h）、0.4 μg/ml MMC（無活化代謝系統長期接觸，-S9/24 h）及60 μg/ml CP（活化代謝系統短期接觸，+S9/6 h）。

2.2 供試品溶液處理細胞[2]

取對數生長期的CHL細胞，胰酶消化后調整細胞濃度為1×105個/ml，接種至6孔板，培養過夜后，棄去培養基，分為-S9/6 h組、-S9/24 h組和+S9/6 h組。共孵育24 h后收獲細胞并進行微核檢測。

2.3 細胞分裂阻滯法檢測

采用體外雙核試驗，人工閱片檢驗。在細胞分裂期前加入Cyto B（終濃度為5 μg/ml）以阻滯細胞質分裂，形成雙核細胞，從而可在完成一次細胞分裂的細胞中進行微核的識別及微核發生率的選擇性分析。閱片前用5 %姬姆薩染色。每組至少分析500個細胞，用復制指數（replication index，RI）評價供試品溶液的細胞毒性，試驗用供試品溶液濃度為與陰性對照相比RI降低（45±5）%的濃度，試驗組和對照組各分析2000個完整的雙核細胞。

2.4 流式細胞術檢測

根據In Vitro MicroFlow Plus Kit試劑盒操作步驟進行。采用疊氮溴化乙錠（EMA）和死細胞核酸染料（SYTOX Green）雙染料染色的方法區分凋亡、壞死和正常細胞，排除凋亡或壞死細胞對試驗結果的影響。為保證需要的細胞都在邏輯門內，在檢測前先用介質對照調試模板，每組至少分析20 000個細胞。

2.5 結果分析與評價

采用SPSS軟件進行統計學分析，微核率比較使用Fisher精確概率法、四格表卡方檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

3 結果

3.1 細胞分裂阻滯法體外微核試驗結果

含微核的雙核細胞實例見圖1。在有和無S9代謝活化系統的情況下，所有試驗組的RI均大于55 %，兩種介質的雙核細胞微核率與介質對照相比差異均無統計學意義（P＞0.05），陽性對照組結果均顯著高于介質對照組（見表1），表明該供試品溶液無致誘變性。

表1 細胞分裂阻滯法體外微核試驗結果

圖 1 含不同數目微核的雙核細胞實例

3.2 流式細胞術檢測結果

在有和無S9代謝活化系統的情況下，SC供試品溶液（圖b1～3）和含血清培養基供試品溶液（圖b4～6）的細胞微核率與介質對照（圖a1～6）相比差異均無統計學意義（P＞0.05），陽性對照（圖c1～3）與介質對照相比差異有統計學意義（P＜0.05），表明該供試品溶液無致誘變性。各組微核率的數值見表2。

表 2 流式細胞術體外微核結果

4 討論

體外微核試驗是檢測醫療器械是否有遺傳毒性的重要方法之一[3]。目前流式細胞術檢測體外微核的CHO細胞試驗數據相對較多[4-6]，但CHL細胞的相關數據很少。本實驗室已根據YY/T 0870.6-2019，采用CHL細胞分裂阻滯法檢測微核，并在本研究中首次將流式細胞術體外微核檢測應用于醫療器械的遺傳毒性檢測，獲得CHL細胞的流式細胞術體外微核試驗數據，填補了該方法在醫療器械檢測應用中的空白。

根據GB/T 16886.12-2017的規定，一次性使用結扎夾屬于不規則固體產品，選擇0.2 g/ml的浸提比例，選用（37±1）℃，（72±2）h，60 r/min條件下浸提，用于遺傳毒性試驗。結果顯示，每組的RI值顯示此一次性結扎夾沒有細胞毒性，故只對100 %濃度供試品溶液進行分析。細胞分裂阻滯法結果顯示，無S9陽性對照（MMC作為陽性對照物）的微核率是陰性對照的3倍左右，有S9時陽性對照（CP作為陽性對照物）的微核率約為陰性對照的4倍，表明該方法體系的合理性。每組微核率與介質對照相比，差異均無統計學意義。流式細胞儀術結果顯示，無S9陽性對照（MMC作為陽性對照物）的微核率是陰性對照的4倍左右，有S9時陽性對照（CP作為陽性對照物）的微核率約為陰性對照的5倍，體系成立。在有和無S9的情況下，兩種供試品溶液的微核率與對照相比差異均無統計學意義，且微核率與細胞分裂阻滯法檢測結果一致，即此供試品溶液在本試驗條件下對CHL細胞無誘變性。

圖2 流式細胞術檢測結果

本研究根據GB/T16886.3-2019中遺傳毒性檢測方法進行，細胞分裂阻滯法和流式細胞術兩種體外微核檢測方法在有和無活化代謝系統條件下，一次性使用結扎夾的試驗結果一致，與介質對照相比差異均無統計學意義，陽性組的微核率為介質對照的3～5倍，表明兩種方法均可應用于醫療器械遺傳毒性的檢測。細胞分裂阻滯法人工閱片首先要識別雙核細胞，然后判斷微核[7]。雙核細胞中無論有一個微核還是多個微核（圖1），在計數發生畸變的細胞時都按一個細胞進行計算統計。人工讀片容易受閱片人的專業知識、日常積累的經驗及主觀因素的影響。相比于細胞分裂阻滯法，流式細胞術通過雙熒光法檢測，先用EMA染色凋亡或壞死的細胞，然后經RNA酶及細胞膜裂解液處理后，標記SYTOX Green，該方法更具有客觀性，采用EMA和SYTOX Green雙染料染色的方法以區分凋亡、壞死和正常細胞，達到排除凋亡或壞死細胞對試驗結果的影響，從而減少產生假陽性結果的幾率，提高檢測的準確性和靈敏性，能獲得更全面、可靠的遺傳毒性評價結果[8]；操作更簡便；可減少人工閱片的誤差；檢測細胞數量多，速度快，效率高；統計的樣本量大幅增加，評價結果更客觀；檢測結果更直觀，能提供多種細胞參數，可檢測細胞毒性，分辨出非整倍體畸變劑和誘變劑，分析細胞周期信息，遺傳毒性的作用方式[5]等。

隨著醫療器械使用范圍和應用風險的增加，迫切需要更加客觀、科學的檢測手段來如實、準確、快速地評價醫療器械遺傳毒性等生物安全性。本研究能為相關標準制定提供可靠依據，具有重要的參考價值。