高效離子色譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中單糖及功能性低聚糖的研究

（遼寧省食品檢驗檢測院（遼寧省鹽品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心），遼寧 沈陽 110015）

糖是人體所需能量最主要的來源，也是嬰幼兒生長發(fā)育的必需品之一。嬰幼兒配方奶粉是參照母乳的組成成分，以乳類和乳蛋白制品為原料配制而成的，含有豐富的營養(yǎng)成分，單糖和功能性低聚糖也是其重要組成成分。目前糖類物質(zhì)的分析主要有3類方法：化學(xué)法、色譜法和酶學(xué)法[1-9]。離子色譜法結(jié)合金電極脈沖安培檢測是目前糖類物質(zhì)分離和定量分析的理想方法，該方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，樣品無需復(fù)雜的樣品前處理，操作簡便迅速，能同時測定多種離子。為此，本研究建立對葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖4種單糖和棉子糖、水蘇糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖、蔗果九糖9種功能性低聚糖的同時檢測離子色譜法，并對市售樣品進(jìn)行測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ICS-5000離子色譜儀（美國戴安），配備脈沖安培檢測器，金工作電極和銀/氯化銀參比電極；CarboPacTMPA20型分析柱（3 mm×150 mm，美國戴安）；CarboPacTMPA20保護(hù)柱（3 mm×50 mm，美國戴安）； X1R高速冷凍離心機(jī)（美國熱電公司）；Milli-Q A10純水機(jī)（美國Millipore公司）.

1.2 材料

葡萄糖對照品（中國計量研究院，含量99.6 %）；果糖對照品（中國計量研究院，含量99.7 %）；蔗糖對照品（中國計量研究院，含量99.7 %）；棉子糖對照品（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%）；水蘇糖對照品（Sigma，含量98.0 %）；麥芽糖對照品（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.5 %）；蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖，蔗果六糖，蔗果七糖，蔗果八糖，蔗果九糖對照品（成都瑞芬斯生物科技有限公司，純度＞98 %）；NaOH（美國賽默飛，色譜級）；乙酸鈉（美國賽默飛，色譜級)；試驗用水為一級水；嬰幼兒配方奶粉（市售）。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、水蘇糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖和蔗果九糖對照品適量, 用超純水稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為1.0 mg/ml的混合對照品儲備液，4 ℃保存。將上述儲備液用超純水稀釋為10 mg/L的混合對照品中間液。用時臨用現(xiàn)配。

2.2 淋洗液的配制

流動相B：取50 %氫氧化鈉溶液6.5 ml，用水稀釋定容至500 ml，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下?lián)u勻，配制成250 mmol/L氫氧化鈉淋洗溶液。

流動相C：稱取20.5 g無水乙酸鈉，用水溶解并定容至500 ml，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下?lián)u勻，配制成500 mmol/L乙酸鈉淋洗溶液。

2.3 樣品處理

取試樣0.5 g，精密稱定，置入20 ml量瓶，加入16 ml 60 ℃溫水溶解，渦旋2 min，超聲20 min，加入3 %乙酸溶液0.4 ml，取出，放置至室溫，加水定容至刻度，搖勻，于4 ℃、8000 r/min離心3 min。取上清0.2 ml，加水稀釋至10 ml，搖勻，過0.22 μm濾膜和RP柱，續(xù)濾液供色譜分析備用。

2.4 色譜條件

色譜柱：CarboPacTMPA20（3 mm×150 mm）分析柱，CarboPacTMPA20（3 mm×50 mm）保護(hù)柱；柱溫：30 ℃；梯度洗脫，程序見表1。檢測方式：脈沖安培法檢測，金電極，銀/氯化銀參比電極；糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形見表2。進(jìn)樣量：25 μl。

表1 淋洗液洗脫程序

表2 糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形

3 結(jié)果與分析

3.1 離子色譜淋洗液選擇

采用離子色譜分析糖類物質(zhì)，單糖測定通過調(diào)節(jié)不同濃度氫氧化鈉淋洗液達(dá)到較好分離效果。功能性低聚糖測定采用氫氧化鈉和乙酸鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，乙酸鈉可增強(qiáng)洗脫效果，改善功能性低聚糖的分離度，縮短分析時間，提高靈敏度。綜合考慮單糖和功能性低聚糖靈敏度、峰形及分析時間，通過實驗確定梯度洗脫條件見表1。

3.2 色譜柱選擇

本試驗采用CarboPacTMPA20色譜柱對4種單糖和9種功能性低聚糖進(jìn)行分離，效果較好。采用PA10、PA1色譜柱對單糖和功能性低聚糖進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，單糖分離效果沒有太大變化，但各低聚糖的保留時間明顯延長，蔗果三糖～蔗果九糖色譜峰均出現(xiàn)拖尾。與PA20色譜柱相比，PA1、PA10色譜柱粒徑稍大，柱效明顯低于PA20，故選擇PA20色譜柱作為分析柱。單糖和功能性低聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖見圖1。

圖1 單糖和功能性低聚糖對照品溶液的離子色譜圖

由圖1可見，在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，采用CarboPacTMPA20色譜柱實現(xiàn)了4個單糖和9個功能性低聚糖的基線分離。

3.3 樣品前處理沉淀試劑選擇

糖極易溶于水，故采用水作為提取溶劑，為了沉淀奶粉中的蛋白質(zhì)，需在提取溶劑中加入一定比例沉淀試劑。依據(jù)參考文獻(xiàn)，本實驗先后選用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅蛋白、乙腈、3 %乙酸作為沉淀試劑。采用乙腈、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅蛋白沉淀試劑，提取效果不好，樣品回收率低，因此選用3 %乙酸作為沉淀試劑，考察加入不同體積的3 %乙酸，結(jié)果顯示水-3 %乙酸體積比為5:1時樣品提取完全，提取效果滿意。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限結(jié)果

按2.1項方法配制5個水平的混合對照品溶液，并在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行檢測。以目標(biāo)化合物的峰面積電信號（y）作為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)繪制曲線，見表3。4個單糖線性范圍為0.1～5 mg/L，9個功能性低聚糖的線性范圍為0.2～10 mg/L，相關(guān)系數(shù)r均大于0.996，線性關(guān)系良好，檢出限為2 mg/100 g。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限結(jié)果

3.5 回收率和精密度

向空白樣品中添加4種單糖和9中功能性低聚糖對照品儲備液，制備含量分別為10，25，50 mg/100 g的加標(biāo)樣品，按2.3項處理方法及2.4項測定條件進(jìn)行回收率試驗，每個添加水平平行測定，結(jié)果見表4。各化合物的平均回收率為82.0 %～106.1 %，RSD為2.7 %～8.9 %。

表4 回收率試驗結(jié)果

3.6 實際樣品檢測

采用本試驗建立的離子色譜方法，對市場上銷售的不同品牌的嬰幼兒奶粉中的糖含量進(jìn)行了檢測。10批次嬰幼兒配方奶粉樣品中功能性低聚糖含量約在400～600 mg/100 g范圍內(nèi)。

試驗結(jié)果顯示，目前市場上銷售的嬰幼兒配方奶粉中檢出棉子糖、水蘇糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖等功能性低聚糖，蔗果七糖及以上低聚糖在少數(shù)奶粉品牌中有檢出，這可能跟原料的工藝有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致加到奶粉中的蔗果七糖及以上的低聚糖含量較低。

4 討論

本試驗通過采用離子色譜-金電極脈沖安培法，選用靈敏度高的CarboPacTMPA20色譜柱，建立快速定量檢測樣品中單糖、棉子糖、水蘇糖和功能性低聚果糖含量的方法。通過對樣品前處理條件和離子色譜參數(shù)優(yōu)化，實現(xiàn)了4種單糖和9種功能性低聚糖的同時分離檢測。該方法適用于嬰幼兒配方奶粉中單糖及低聚糖的檢測，具有較高的應(yīng)用價值。