超高效液相色譜-波長切換法同時測定健脾丸（濃縮丸）中4種成分的含量

鄭 昆，倫志彩，羅兆亮

（1.日照市中醫醫院，山東 日照 276800；2.莒縣中醫醫院，山東 莒縣 276599；3.臨沂萊博醫藥技術有限公司，山東 臨沂 276017）

健脾丸（濃縮丸）是由黨參、炒白術、陳皮、枳實（炒）、炒山楂和炒麥芽六味中藥組成的中藥制劑，其功能主治為健脾開胃，用于脾胃虛弱，脘腹脹滿，食少便溏[1]。其中黨參具有健脾益肺，養血生津作用[2]；炒白術具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎作用[2]。陳皮和枳實具有理氣健脾，破氣消積，化痰散痞作用。健脾丸是臨床常用的中藥制劑，其濃縮丸質量標準收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊。經查閱相關文獻[3-4]，均以陳皮和枳實中共同存在的橙皮苷和柚皮苷等指標成分的含量測定對健脾丸進行質量控制[5-8]。目前，現有文獻中缺少對處方中黨參和白術的質量控制方法。超高效液相色譜技術（UPLC）與傳統高效液相色譜（HPLC）相比，具有分析速度快、靈敏度高、節約流動相等優點[9-11]，尤其是對多組分樣品進行分析時，可顯著提高分析效率。本文以黨參和白術中4種特有成分黨參炔苷（黨參）、白術內酯I、II、III（白術）作為指標成分，采用UPLC技術，建立含量測定分析方法，對健脾丸中的黨參和白術進行質量分析，從而控制健脾丸的質量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1290型超高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱（美國Agilent公司）；Meteler XP205型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-600DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；A10型超純水機[密理博（中國）有限公司]。

1.2 試藥

黨參炔苷對照品（批號：111732-201908，純度100 %），白術內酯I對照品（批號：111975-201501，純度99.9 %），白術內酯II對照品（批號：111976-201501，純度99.9 %），白術內酯III對照品（批號：111978-201501，純度99.9 %，中國食品藥品檢定研究院）；健脾丸（規格：濃縮丸，每8丸相當于原生藥3 g，批號：191104，19110202，191004，仲景宛西制藥股份有限公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙酸（色譜純），超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Poroshell 120 SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流速為0.5 ml/min；檢測波長為270 nm（0～13.5 min，檢測黨參炔苷和白術內酯III）和220 nm（13.5～25 min，檢測白術內酯I和白術內酯II）；柱溫為30 ℃；進樣量為5 μl；流動相為乙腈（A）-0.1 %乙酸（B），梯度洗脫：0～9 min，20 %A～50 %A；9～16 min，50 %A～55 %A；16～25 min，55 %A～100 %A。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取本品，研碎，精密稱取約2.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流提取1 h，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取黨參炔苷照品101.57 mg，白術內酯I對照品16.43 mg，白術內酯II對照品10.67 mg，白術內酯III對照品18.61 mg，分別置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各對照品儲備溶液；分別精密量取各對照品儲備溶液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊中收載健脾丸（濃縮丸）的處方制法，分別制備不含黨參與不含白術的陰性樣品，然后按供試品溶液的制備方法，分別制備缺少黨參陰性樣品溶液和缺少白術陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、缺黨參陰性樣品溶液與缺白術陰性樣品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果各成分色譜峰峰形對稱，分離度良好。在缺少黨參陰性樣品溶液和缺少白術陰性樣品溶液色譜圖中4種待測成分相應保留時間處沒有其他色譜峰，說明不存在其他成分的干擾。

圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

2.4 線性關系試驗

取2.2.2項下對照品儲備溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 ml，分別置100 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得各對照品標準系列溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以各對照品溶液的濃度（x，μg/ml）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，制備標準曲線方程。標準曲線方程和相關系數（r）結果見表1。

表1 4種待測成分回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗

精密量取2.2.2項下對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，連續測定6次，記錄4種待測成分峰面積的RSD分別為1.17 %，1.04 %，1.28 %和1.05 %，表明方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取本品（批號：191104），按2.2.1項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h進樣，記錄4種待測成分色譜峰面積。結果4種成分峰面積的RSD分別為1.33 %，1.42 %，1.26 %，1.34 %，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取本品（批號：191104），按2.2.1項下方法制備供試品溶液，共6份，分別進樣測定，記錄各成分色譜峰面積并按照標準曲線法計算其含量。結果，4種成分含量的RSD（n=6）分別為1.52 %，1.35 %，1.67 %，1.82 %，表明方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：191104），精密稱取1.0 g，共6份，置錐形瓶中，分別精密加入4種待測成分對照品貯備溶液各0.5 ml，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算4種待測成分的回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.9 耐用性試驗

取2.2項下供試品溶液，分別改變高效液相色譜儀（Agilent 1290和LC20A）、色譜柱型號[Poroshell 120 SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Accucore C18（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）]、柱溫（30 ℃、40 ℃和室溫）和流速（0.45，0.5，0.55 ml/min）等條件，考察其對檢測結果的影響。結果表明，在上述范圍內改變色譜條件，各色譜峰的分離度良好，表明本方法的耐用性良好。

2.10 樣品測定

取健脾丸3批，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算各成分的含量，結果見表3。不同批次產品的含量基本一致，說明本藥在不同批次間的質量較為穩定。

表3 含量測定結果（n=2）

3 討論

3.1 流動相的選擇

本試驗比較了分別以甲醇-水與乙腈-水作為流動相的洗脫效果。選擇甲醇-水作為流動相時，黨參炔苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度較差，且白術內酯III色譜峰峰形較差，色譜系統的壓力較高，對色譜柱不利。選擇乙腈-水作為流動相時，色譜系統壓力較低，有利于保護色譜柱，黨參炔苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度較好，為了改善色譜峰的峰形，在水中加入0.1 %乙酸，此時各待測成分色譜峰峰形對稱，因此，本試驗選擇乙腈-0.1 %乙酸溶液作為流動相。

3.2 檢測波長的選擇

本試驗采用二極管陣列檢測器，掃描4種待測成分的紫外吸收曲線（見圖2），發現黨參炔苷和白術內酯III在270 nm波長處具有較強紫外吸收，白術內酯I和白術內酯II在220 nm波長處具有較強紫外吸收，為了提高各成分的響應值，提高檢測靈敏度，本文采用檢測波長切換法，分別選擇270 nm（0～13.5 min，檢測黨參炔苷和白術內酯Ⅲ）和220 nm（13.5～25 min，檢測白術內酯I和白術內酯II）作為4種待測成分的檢測波長。

圖2 不同檢測波長HPLC圖譜

健脾丸（濃縮丸）是《衛生部藥品標準》中收載的中成藥制劑，該藥在臨床使用中用量較大，現行質量標準和已發表的文獻僅對組方中陳皮和枳實進行質量控制，缺少對黨參和白術的質量控制。本文采用UPLC，以黨參和白術為研究對象，對黨參和白術中4種成分進行含量測定，可有效控制該制劑中黨參和白術的質量。本文研究方法重復性好，結果準確，可為健脾丸（濃縮丸）質量控制提供技術支撐。