miRNA-183在噪聲性耳聾大鼠耳蝸組織中的表達及臨床意義

唐一萍，馮 俊，馬 鵬，羅德艷

(南充市中心醫院 川北醫學院第二臨床醫學院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充637000)

近年，隨著我國城市化以及工業科技的不斷發展，噪聲污染日益嚴重。噪聲性耳聾成為了軍事、建筑業、工業、娛樂業、交通行業等最常見的聽力致殘因素。以往有研究報道[1]，噪聲性耳聾與耳蝸組織發生機械性損傷以及代謝障礙密切相關。人體長時間處于噪聲環境中過度的刺激會導致耳蝸毛細胞壞死或凋亡。而隨著對噪聲性耳聾發生機制的不斷深入研究，有學者發現噪聲性耳聾的發生受環境、基因雙重因素所影響[2-3]。miRNA在生物體發生發展過程中的作用已有多項基礎研究所證實，其中，miRNA-183家族在內耳中含有豐富的表達，且在內耳發育過程中有著重要的調控作用[4]。相關研究[5]表明，miRNA-183家族與聽力受損具有一定的相關性。本研究通過動物實驗研究miRNA-183在噪聲性耳聾大鼠耳蝸組織中的表達情況，并嘗試分析其對噪聲性耳聾發生發展的影響，旨在為噪聲性耳聾的診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型 50只健康SD大鼠，均由四川大學實驗動物中心提供，25只雄鼠，25只雌鼠，體重100～200 g,8周齡，自由喂養，不限制飲食，而且大鼠的耳廓反射均靈敏，無噪聲接觸史、耳毒藥物服用史或中耳炎等。將50只SD大鼠分為兩組，其中，將10只SD大鼠不予任何處理設為空白對照組，另40只大鼠均進行噪聲暴露以建立噪聲性耳聾動物模型，將其分為噪聲暴露1 d組(n=10)、噪聲暴露7 d組(n=10)、噪聲暴露14 d組(n=10)、噪聲暴露28 d組(n=10)。本研究實驗內容、實驗方法等均遵循了《實驗動物管理與使用指南》(科學出版社出版)，均經醫院倫理委員會審批同意。

1.2 噪聲性耳聾動物模型建立 在隔音房內利用白噪聲播放軟件播放白噪聲，將音量調至最大，噪聲強度設置為120 dB SPL，將實驗大鼠頭部放到聲源正前方2 cm處，每日持續噪聲暴露4 h，連續4 d，建立噪聲性耳聾動物模型。

1.3 耳蝸基底膜鏡檢 對照組及各組噪聲暴露后立即進行大鼠斷頭處死，即刻去除雙側聽泡，放在PBS溶液中浸泡，借助手術放大鏡將蝸殼去除，并將基底膜連帶蝸軸取出，置于-80 ℃低溫冷凍環境中儲存。取適量耳蝸基底膜鋪片，并予以0.5%硝酸銀溶液進行染色，在生物顯微鏡(10×40)視野下察看耳蝸毛細胞受損情況，與正常耳蝸毛細胞相比，受損的毛細胞會出現不規則排序，或在正常毛細胞排列中有空缺等。計算出各組耳蝸基底膜中外毛、內毛細胞的缺失率，并以此作為毛細胞損傷判斷指標。內外毛細胞缺失率計算方法：在顯微鏡下應用目鏡中長度0.24 mm標尺對耳蝸基底膜頂回至底回毛細胞存活/缺失數目進行計數，并與頂回頂點的距離形成線性函數關系，借助Sigma Plot軟件回執耳蝸毛細胞圖，且應用耳蝸毛細胞定量分析軟件計數毛細胞缺失率。

1.4 miRNA-183測定

1.4.1 試劑與儀器：Trizon總RNA提取試劑(上海聯邁生物)，Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒(上海一基生物)，Ultra SYBR Mixture試劑盒(上海研謹生物)，Bio-Rad CFX384實時定量PCR儀(美國伯樂)，T10手持式勻漿機(德國IKA)，超低溫冰箱(松下)，AL104電子天平(瑞士梅特勒)，TG-16S微量高速離心機(上海錦玟)，Olympus CX22雙目顯微鏡。

1.4.2 操作方法：①總RNA提取：取各組耳蝸組織樣本應用手持式勻漿機將其碾碎，研磨成粉末狀置于EP管中，按照35 mg樣本加入1 ml Trizon液的比例加入適量Trizon液混勻，并反復進行吹打以使樣本充分裂解。將樣本在室溫中靜置5 min，待蛋白核酸復合物完全分離后再在EP管中添加0.2 ml的氯仿溶液，劇烈震蕩，室溫放置5 min后進行離心處理(1200 r/min，4 min)。另取新EP管，往內加入分離后的上清液300 ml、異丙醇溶液500 μl混勻，在4 ℃環境中放置20 min。再次以相同條件進行離心處理80 min，將沉淀物取出，用75%酒精洗滌，離心處理4 min，棄上清液。待沉淀物晾干后添加二乙基焦碳酸酯處理水20 μl混勻震蕩以溶解RNA。②cDNA合成：應用RT-PCR法進行檢測，取5 μl RNA為逆轉錄模板，miRNA-183的相對表達量以U6 RNA為內參基因，嚴格按照Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒進行操作，加入引物(正向序列：5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’；反向序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’)充分震蕩混勻，并予以短暫離心處理以使溶液集中于EP管底。然后將其置于42 ℃環境中孵育30 min，置于85 ℃中孵育3 min。最后對其進行短暫離心處理，并放在冰上冷卻獲得逆轉錄產物cDNA。③實時定量PCR反應：嚴格按照Ultra SYBR Mixture試劑盒說明書進行熒光實時定量PCR實驗，設置反應條件：預變性95 ℃,10 min，變性95 ℃,15 s，退火/延伸60 ℃,1 min，40個循環，并應用實時定量PCR儀測定循環閾值(Ct)，每組樣品作3個復孔，取平均值。以2-△△Ct法表示各組miRNA-183的相對表達量，其中，△Ct=目的基因Ct均值-內參基因Ct均值，△△Ct=待測樣本△Ct值-校正器△Ct值。

1.5 觀察項目 ①比較各組大鼠耳蝸基底膜的外毛細胞、內毛細胞缺失率;②比較各組大鼠耳蝸組織的miRNA-183相對表達量。

1.6 統計學方法 數據錄入到Microsoft Excel 2013軟件中，并進行邏輯性整理，刪除不合邏輯的數據，然后再采用SPSS 23.0統計學軟件處理，計量資料采用不假定方差齊性Brown-ForsytheF統計量作為校正值進行方差分析，同時應用不要求方差齊性的Tamhane事后檢驗，且兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異存在統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠耳蝸基底膜外內毛細胞形態 鏡檢下見空白對照組大鼠的耳蝸基底膜有1排內毛細胞、3排外毛細胞，排列整齊，無毛細胞缺失(圖1)，經單因素方差分析以及Brown-Forsythe檢驗結果顯示，不同噪聲暴露時間內膜細胞缺失率無統計學差異(F=1.571，P=0.215)。而Brown-Forsythe檢驗結果顯示，不同噪聲暴露時間之間的外毛細胞總缺失率有統計學差異(F=69.401，P=0.000)。Tamhane事后檢驗發現，噪聲暴露28 d組、噪聲暴露14 d組、噪聲暴露7 d組的外毛細胞缺失率均顯著高于噪聲暴露1 d組(均P<0.01)，且噪聲暴露28 d組的外毛細胞缺失率明顯高于噪聲暴露14 d組、噪聲暴露7 d組(均P<0.01)。見表1。

圖1 空白對照組大鼠耳蝸基底膜鋪片鏡檢結果(OHC外毛細胞，IHC內毛細胞)

表1 不同噪聲暴露組大鼠耳蝸基底膜外內毛細胞缺失率比較(%)

2.2 各組大鼠耳蝸組織miRNA-183相對表達量比較 經單因素方差分析以及Brown-Forsythe檢驗結果顯示，空白對照組、不同噪聲暴露時間之間的miRNA-183相對表達量差異均有統計學意義(F=99.728，P=0.000)。Tamhane事后檢驗發現，噪聲暴露28 d組、噪聲暴露14 d組、噪聲暴露7 d組、噪聲暴露1 d組的miRNA-183相對表達量顯著低于空白對照組(均P<0.01)。噪聲暴露1 d組、噪聲暴露7 d組的大鼠耳蝸組織miRNA-183相對表達量明顯低于噪聲暴露14 d組、噪聲暴露28 d組(均P<0.01)，且噪聲暴露14 d組的miRNA-183相對表達量顯著低于噪聲暴露28 d組(t=4.988，P=0.000)。而噪聲暴露1 d組、噪聲暴露7 d組之間miRNA-183相對表達量比較差異無統計學意義(t=1.980，P=0.063)。見表2。

表2 各組大鼠耳蝸組織miRNA-183相對表達量比較

3 討 論

近年，隨著臨床對內耳損傷機制研究的不斷深入，已有大量研究證實[6]，耳蝸基底膜毛細胞在內耳的正常發育、損傷修復中發揮重要的基礎，同時也是多種內耳疾病發生發展的病理生理基礎。動物實驗研究發現[7]，經高強度噪聲暴露后大鼠的耳蝸受損區內存有壞死毛細胞。Blioskas等[8]的研究將健康成年豚鼠置于聲壓級55 dB SPL、頻譜2000 Hz噪聲環境中國暴露28 d，發現其耳蝸內有大量的毛細胞壞死、凋亡。相關文獻[9-10]也報道，永久性聽力閾移的病理生理基礎是耳蝸內毛細胞出現不可逆性病理損害，致使毛細胞缺失，而且在此過程中最易受到損害的是外毛細胞，其次是支持細胞，最后為內毛細胞。本研究經硝酸銀溶液染色鏡檢后發現，空白對照組大鼠的耳蝸基底膜內毛、外毛細胞排列整齊，無細胞缺失，而噪聲暴露1 d組、噪聲暴露7 d組、噪聲暴露14 d組、噪聲暴露28 d組的耳底基膜外毛細胞缺失率隨噪聲暴露時間延長而顯著升高，與上述研究報道相符，進一步證實了在噪聲性耳聾發生中會出現毛細胞病理損傷，且最早出現變化的是外毛細胞。但本研究發現，在噪聲暴露的28 d以內內毛細胞無病理性損害，與Peyvandi等[11]的研究結果不相符，筆者推敲可能是本研究在噪聲性耳聾模型建立中的噪音強度、持續時間不足所導致的。

此外，miRNA在內耳中的表達情況及具體功能研究成為了熱門的話題。miRNA是由21～25個小分子核苷酸所組成的非編碼RNA，可廣泛分布在哺乳動物基因組[12]。其中，有研究[13-14]報道，miRNA-183在多項疾病的病變組織中均會出現異常表達，能夠參與細胞凋亡、分化、增殖等許多重要生物學過程。Weston等[15]對小鼠胚胎期到成年期的耳蝸發育情況進行分析研究，發現miRNA-183家族成員在耳蝸發育過程中呈動態性表達，且在耳蝸結構成形、分化中達到峰值。Yang等[16]的研究證實，miRNA-183能夠在一定程度調控內耳毛細胞的分化、發育及成熟過程。本研究對不同噪聲暴露時間大鼠的miRNA-183表達水平進行比較發現，噪聲暴露1、7、14、28 d大鼠的耳蝸miRNA-183表達量較空白對照組逐漸降低。王園園等[17]的研究證實，在噪聲暴露期間耳蝸毛細胞會發生變性、壞死及缺失，促使聽力受損。故筆者結合本研究結果推測噪聲刺激對聽力的損傷可能與miRNA-183表達水平下降有關。與此同時，本研究經事后檢驗顯示，噪聲暴露14、28 d的miRNA-183表達水平較噪聲暴露1、7 d明顯升高。相關文獻[18-19]指出，噪聲暴露過程中除了耳蝸毛細胞會出現缺損改變外，其耳蝸組織內殘存的毛細胞會發生代償性修復，促使祖細胞向毛細胞分化，使殘存的毛細胞具有一定的再生、恢復能力。此說法也可以解釋本研究miRNA-183表達水平在噪聲暴露14、28 d逐漸升高的原因，但需注意鏡檢結果顯示噪聲暴露14、28 d外毛細胞缺失率仍較噪聲暴露1、7 d增加，表明了大鼠耳蝸組織受損后殘存毛細胞的再生修復能力是有限的[20]。

綜上所述，miRNA-183在噪聲性耳聾大鼠耳蝸組織中呈低表達，推測miRNA-183表達量下調可能會促進噪聲性耳聾發生發展，而且對耳蝸毛細胞損傷修復能力評估具有一定的臨床意義。