花生紅衣原花青素純化工藝研究

◎ 黃 武，亢 帥，李亞杰，蒲云峰，侯旭杰

(1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

花生是我國主要農作物之一，主要種植區域分布于山東、河南等地，是重要的經濟作物[1]。花生紅衣作為花生產品加工過程中的副產物，通常得不到充分利用而被廢棄，或作為飼料和燃料等，降低了其利用價值[2]。花生紅衣中含有豐富的多酚類物質，包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等[3-4]，其中原花青素具有強抗氧化能力，它能延緩人體衰老[5-6]，同時還具有抑制病菌生長繁殖、預防心腦血管疾病和降低血糖血脂等功效，是一種新型天然抗氧化劑[7]，如果將其充分利用于醫藥、食品、保健品等行業，將能帶來理想的經濟效益。

粗提原花青素中含有較多雜質，如糖類、多酚、蛋白質和少量脂肪等，因此，分離純化是得到較高純度原花青素必不可少的環節。本研究以花生紅衣為原料，經乙醇提取得到原花青素粗提物，再通過靜態吸附和解吸試驗對8 種大孔樹脂型號進行選擇，然后通過動態吸附和解吸試驗得出最優純化條件，以期為花生紅衣原花青素產品開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

花生紅衣：產地為山東，品種為四粒紅。

8 種型號大孔吸附樹脂（D4020、AB-8、DA201、X-5、D101、NKA-9、LSA-10 和NKA- Ⅱ）， 購 自北京龍天韜略科技有限公司。無水乙醇、甲醇，購自天津市北聯精細化學品開發有限公司；香草醛，純 度≥99%，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；4%香草醛-甲醇溶液：（精確稱取4.00 g 香草醛用甲醇溶解并在100 mL 容量瓶中定容）；鹽酸，購自四川西隴化工有限公司；原花青素標準品，純度≥98%，購自合肥博美生物公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Pilot3-6m 全自動型硅油循環系統凍干機（北京博醫康試驗儀器有限公司）、MP0106C 平流泵（上海三為科技儀器有限公司）、SHA-B 水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）、RE-3000A 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、SB-5200DT 數控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）、EMS-20 數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋（金壇市科順儀器廠）、LE203E/02 電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、TGL-20br 高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）及UV-2450 紫外可見光分光光度計（島津公司）。

1.3 花生紅衣原花青素粗提物的制備

稱取干燥花生紅衣粉碎成粉末狀。用適量石油醚對紅衣粉末進行脫脂：常溫下浸泡24 h，間歇攪拌，抽濾、烘干，得到花生紅衣脫脂粉末。參考王菲[8]等的提取方法并加以改進，將花生紅衣粉末按料液比（g ∶mL）1 ∶45 加入到60%的乙醇溶液中，經 35 ℃下超聲15 min 后轉入水浴鍋，在50 ℃下水浴 50 min，然后將得到的溶液在4 000 r·min-1條件下離心10 min，取出上層澄清液。澄清液經旋轉蒸發去除乙醇后，真空冷凍干燥制成原花青素粗提取凍干粉備用。

1.4 原花青素的含量測定

鹽酸-香草醛法測定原花青素：準確吸取3 mL 香草醛-甲醇溶液、1.5 mL 濃鹽酸于試管中，再吸取樣品液0.5 mL，迅速混勻，在避光條件下進行20 min 顯色反應，測定吸光度[9]。

1.5 花生紅衣原花青素分離純化

1.5.1 大孔樹脂的預處理

大孔樹脂在制備過程中常殘留一些有毒有害的有機物，對試驗會產生較大的影響，所以新購大孔樹脂必須經過預處理才能正常使用，預處理方法如下：將大孔樹脂放入大燒杯，并在其中加入無水乙醇進行浸泡，24 h 后對其進行抽濾，再次在燒杯中加入無水乙醇，重復多次直至乙醇溶液與水在體積比為1 ∶5 的狀態下不渾濁。之后將抽濾后的樹脂多次用去離子水清洗直至樹脂沒有乙醇味為止，再將樹脂浸泡于濃度為5%的HCl 溶液中，4 h 后對樹脂進行抽濾，用去離子水多次清洗直到溶液的酸堿度為中性，最后將樹脂置于濃度為2%的NaOH 溶液中繼續浸泡4 h，之后將樹脂抽濾后用去離子水沖洗至酸堿度顯中性，對樹脂進行抽濾并用吸水紙擦干表面水分，備用。此樹脂即可進行后續實驗操作。

1.5.2 大孔樹脂的靜態吸附和解吸試驗

靜態吸附：稱取1 g大孔樹脂放入50 mL錐形瓶中，在其中加入濃度為2.22 mg·mL-1的原花青素提取液 20 mL 并均勻混合，將該錐形瓶放入水浴恒溫振蕩器（120 r·min-1，30 ℃）中進行吸附試驗，24 h 后測定其吸光度，并由各吸光度值來考察樹脂對原花青素的吸附率和解吸率。

靜態解吸：過濾吸附飽和的大孔樹脂放入50 mL錐形瓶中，加入濃度為95%的乙醇20 mL。將該錐形瓶置于水浴恒溫振蕩器（120 r·min-1，30 ℃），在與靜態吸附同樣的條件下進行解吸，12 h 后測定乙醇溶液中原花青素的吸光度。

樹脂的吸附率、泄漏率和解吸率按式（1）、（2）和（3）進行計算。

純化物純度=純化物中原花青素質量/純化物質量×100%

式（1）、（2）、（3）中：C0-原花青素提取液的濃度，單位為mg·mL-1；C1-經樹脂吸附后溶液濃度，單位為mg·mL-1；A0-總吸光度；A1-解吸吸光度。

1.5.3 大孔樹脂動態吸附試驗

（1）動態吸附動力學曲線。取上述試驗選出的大孔樹脂，經預處理后，采用濕法裝柱填充于層析柱，配制一定濃度的樣液，控制上樣流速，每5 mL 收集一次流出液，測定其吸光度值，當測定出大孔樹脂流出液的吸光度值基本保持不變，則大孔樹脂吸附飽和，停止進樣，根據所得數據繪制動力學曲線。

（2）上樣濃度對大孔樹脂吸附原花青素的影響。將預處理好的樹脂，裝入2.0 cm×50 cm 的玻璃層析柱中，樹脂高度為10 cm，分別配制濃度為0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1和2.5 mg·mL-1的原花青素溶液，以1.0 mL·min-1的流速進行上樣。收集流出液，測定吸光值，以泄漏率為指標，考察上樣濃度對大孔樹脂吸附原花青素的影響。

（3）上樣流速對大孔樹脂吸附原花青素的影響。將預處理好的樹脂，裝入2.0 cm×50 cm 的玻璃層析柱中，樹脂高度為10 cm，分別配制濃度為1.0 mg·mL-1的 原 花 青 素 溶 液，以0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、 1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1和2.5 mL·min-1的流速進行上 樣。收集流出液，測定吸光值，以吸附率和泄露時間為指標，考察上樣流速對大孔樹脂吸附原花青素的影響。1.5.4 大孔樹脂動態解吸試驗

（1）洗脫液濃度對大孔樹脂解吸原花青素的影響。因粗提原花青素含有較多雜質，大孔樹脂吸附時將雜質也一并吸附，要得到純度較高的原花青素就需先除雜。待大孔樹脂吸附飽和后，首先用去離子水將蛋白質、多糖等大分子雜質洗去；然后分別用0%、20%、40%、60%和80%的乙醇溶液以1.0 mL·min-1流速將原花青素洗脫下來，每5 mL 收集一次流出液，測定吸光值，以洗脫液原花青素質量濃度為指標，考察不同體積分數乙醇對原花青素的洗脫效果。

（2）洗脫流速對大孔樹脂吸附原花青素的影響。同上述洗脫液濃度影響實驗，洗去雜質后，用40%的乙醇溶液以0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1和2.5 mL·min-1將原花青素洗脫下來，每5 mL 收集一次流出液，測定吸光值，以解吸率和純度為指標，考察不同洗脫流速對原花青素的洗脫效果。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂的吸附和解吸能力與樹脂的結構和性質有關。本研究對8 種不同規格大孔樹脂進行吸附和解吸實驗結果如表1 所示，可以看出，對原花青素吸附效率最高的樹脂是弱極性LSA-10 型，其次是非極性的D4020 型。解吸率最高的樹脂為非極性的D4020 型，其次是非極性的D101 型。LSA-10 樹脂與D4020 樹脂對花生紅衣原花青素的吸附率相近，但就解吸效果而言D4020 樹脂的解吸率比LSA-10 樹脂略高。所以綜合考慮樹脂的吸附率和解吸率的相互作用，選擇D4020樹脂作為最適樹脂。

表1 不同大孔樹脂的參數以及吸附、解吸率表

2.2 動態吸附曲線

一開始大孔樹脂吸附能力很強，樣液中的原花青素基本能被完全吸附，隨著吸附量的增多，樹脂中孔隙逐漸被填滿，原花青素因無法被吸附而隨著溶劑一起流出，待到樹脂完全飽和，流出液中原花青素量也達到最高，遂出現如圖1 所示結果。吸光值一開始以微小的趨勢上升，當到17 號管時，吸光值開始較快速的上升，30 管之后吸光值達到最高且基本保持不變，即樹脂飽和。

2.3 上樣濃度對大孔樹脂吸附原花青素的影響

泄漏率是考察吸附效果的一種常用方法，泄漏率越小，表明吸附效果越好，泄漏率越大則吸附效果越差。上樣濃度對原花青素吸附效果的影響如圖2 所示，隨著上樣濃度的升高，泄漏率逐漸上升，當濃度達到1.5 mg·mL-1后，泄漏率開始顯著增大。上樣濃度越小，樣液中所含原花青素越少，當大孔樹脂量和上樣速率一定時，低濃度樣液中原花青素能夠被較完全的吸附，隨著濃度升高，樣液中原花青素含量增大，相同速率經過相同量的樹脂時，樹脂不能完全吸附樣液中原花青素，多余的原花青素隨著溶液一同流出，造成泄漏率增大，濃度為1.5 mg·mL-1時，剛好達到吸附與泄露的相對平衡點，所以上樣濃度以1.5 mg·mL-1為最適濃度。

圖1 大孔樹脂動態吸附曲線圖

圖2 上樣濃度對大孔樹脂吸附原花青素的影響圖

2.4 上樣流速對大孔樹脂吸附原花青素的影響

由圖3 可知，吸附率和泄露時間都隨著上樣流速的升高而降低，當流速為0.5 mL·min-1時，吸附率最高，可達87%，但泄露時間過長，在實際生產中不能達到高效生產的目標；流速為1.5 mL·min-1時，泄露時間短，但吸附過程不完全，吸附率僅有76%；流速為1 mL·min-1時，吸附率較高，且泄露時間相對較短，能夠滿足實際生產中快速高效的生產要求，所以選擇1 mL·min-1為最適上樣流速。

2.5 洗脫液濃度對大孔樹脂解吸原花青素的影響

乙醇是大孔樹脂純化中常用的洗脫劑，不同濃度的乙醇其極性不盡相同，對原花青素的洗脫效果也不同，于是考察不同體積分數乙醇對原花青素的梯度洗脫效果，選擇洗脫效果最佳濃度。由圖4 可知，40%乙醇洗脫出的洗脫液濃度最高，峰值明顯，且基本沒有拖尾現象，其次是20%乙醇，洗脫出的溶液濃度較高，峰值明顯，但拖尾現象明顯，其他濃度無明顯峰值，基本沒有原花青素洗脫出。去離子水洗出的基本是蛋白質、糖等水溶性大分子物質；20%乙醇由于其濃度較低，極性也較低，對原花青素的洗脫效果有限；40%乙醇有較高的極性，對原花青素洗脫效果明顯；60%和80%乙醇雖然有很高的極性，理論上對原花青素的洗脫效果應該很好，但由于20%和40%已經將樹脂中的原花青素基本洗出，所以60%和80%乙醇洗脫出的原花青素極其有限。因此，從實際生產角度考慮，選擇40%乙醇作為最適洗脫濃度。

圖3 上樣流速對大孔樹脂吸附原花青素的影響圖

圖4 洗脫液濃度對大孔樹脂解吸原花青素的影響圖

2.6 洗脫流速對大孔樹脂解吸原花青素的影響

如圖5 所示，隨著洗脫流速增加，解吸率和純度皆以降低趨勢呈現，流速越快，乙醇在大孔樹脂間隙停留的時間越短，洗出的原花青素量就越少，所以解吸率降低；在流速為1 mL·min-1時，洗脫液純度最高，而此時解吸率也相對較高，綜合其他流速下的解吸率和純度，流速為1 mL·min-1時最佳。

圖5 洗脫流速對大孔樹脂解吸原花青素的影響圖

3 結論

用大孔樹脂進行分離純化具有多方面的優勢，如大孔樹脂的性質穩定、使用范圍廣、具有良好的分離性能等，最重要的是樹脂能重復使用。與靜態吸附和解吸相比，動態吸附和解吸過程具有快速省時、方便高效、處理量大等優勢，有利于后期對大量原花青素粗提液進行分離純化處理。

試驗通過靜態吸附和解吸試驗對8 種大孔樹脂型號進行選擇，選出最佳型號為D4020，使用該型號樹脂進行動態試驗，對上樣流速、上樣濃度、洗脫液濃度和洗脫流速進行考察，得出最佳純化方案為上樣流速1 mL·min-1，上樣濃度1.5 mg·mL-1，洗脫液為40%乙醇，洗脫流速1 mL·min-1，最終所得純化物純度可達97.35±1.58%。本研究為花生紅衣這一副產物高質化利用提供了一定的理論依據。