超高效液相色譜-串聯質譜法在 食品安全檢測中的應用

◎ 曹 維，譚 杰，鄭茜玥

（武漢海關技術中心，湖北 武漢 430050）

國家標準《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）限定了食品動物中甲砜霉素等藥物殘留限量，但食品中有關氯霉素及甲硝唑等藥物殘留事件報道仍較多[1]。獸藥殘留為目前食品安全面臨的重大問題之一[2-3]。基于液相色譜-串聯質譜法為食品中多種獸藥殘留快速定性篩查的首選方法，且具有分析效率高、靈敏度高的優勢[4]，本文就超高效相色譜-串聯質譜法在動物源性食品檢測中應用效果進行探究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）儀器。LC-30 超高效液相色譜儀（日本島津公司）、ATRAP 5500 三重四極桿液相色譜質譜聯用儀（美國AB SCIEX 公司）、Multi Reax 全能型振蕩器（德國Heidolph 公司）、Centrifuge 5804 高速離心機（德國Eppendorf 公司）、SCIENTZ-950E 超聲波提取器（寧波新芝生物科技公司）、Autovap S60 氮吹儀（美國ATR 公司）、XS-205 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）、Milli-Q 超純水制備系統（美國MILLI-PORE 公司）、HYPERSEP Retain-PEP 固相萃取柱（美國賽默飛公司）、陶瓷均質子（美國安捷倫公司）以及0.22 μm PFP 微孔濾膜（上海安譜科學儀器有限公司）。

（2）試劑與樣品。氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素標準品；豬肉粉中氯霉素、氟苯尼考分析質控樣；乙腈、甲醇和甲酸；實驗用水。樣本為當地農貿市場所采購豬肉、牛肉及羊肉，總計68 批。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理

樣品切碎后，準確稱量5 g 樣品置于50 mL 聚丙烯具塞離心管中，加50 μL 混合同位素內標溶液，放置30 min 后，加pH=9.0 磷酸鹽緩沖液5 mL，渦旋振蕩5 min 后，加乙腈5 mL，混勻后，以1 000 r·min-1冷凍離心共10 min，去上清液后置另一個離心管中，加乙酸乙酯10 mL，渦旋30 s 后，靜置分層，于1 000 r·min-1冷凍離心10 min，去上層液，置15 mL 聚丙烯離心管，40 ℃以下水浴中，氮氣吹至近干，殘留物加0.3 mL甲醇溶液，加5.7 mL 磷酸鹽緩沖液，混勻待凈化。

1.2.2 溶液配制

取標準品氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素，溶于甲醇配制為標準儲備液，濃度為1 mg·mL-1，置于-20 ℃ 下避光保存，有效期6 個月。量取標準儲備液適量，用甲醇稀釋至10 μg·mL-1標準工作液，保存在2 ～8 ℃，有效期1 個月。按1.2.1 處理后，獲取陰性樣品，按照混合標準，配制為質量濃度1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、 20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和100 ng·mL-1混合液。

1.2.3 分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITYUPLC BEH C18 柱；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：10 ℃；流速： 0.4 mL·min-1；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0 ～3.0 min，90%A →60%A； 3.0 ～3.5 min，60%A →15%A，3.5 ～4.0 min， 15%A →10%A，4.0 ～4.5 min，10%A →90%A， 4.5 ～6.0 min，90%A；進樣量：10 μL。

（2）質譜條件。離子源為電噴霧電離源，負離子掃描，多反應模式監測。毛細管電壓：2.5 kV（負離子）和4.0 kV（正離子）；離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：1 000 L·h-1，碰撞氣流量：0.13 mL·min-1。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的離子對、去簇電壓、碰撞氣能量和碰撞室出口電壓見表1。

表1 質譜條件相關參數表

1.2.4 線性分析

陰性樣品處理液獲取混合配制，1 ng·mL-1、 5 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、75 ng·mL-1和 100 ng·mL-1系列基質標準曲線，并上機測定。將目標化物定量離子峰面積歸為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 精密度測定

對質量濃度為10.0 ng·mL-1的3 種目標物標準溶 液，開展6 次重復測定，測定精密度。

1.2.6 樣品測定

吸取1 mL 上清液加入使用前依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化處理過的弱陰離子固相萃取柱中，待樣品以低于1.0 mL·min-1的流速全部通過固相萃取柱，再分別用3 mL 去離子水和3 mL 甲醇淋洗，流速為 1 mL·min-1，應用10 mL 2%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液在45 ℃水浴中氮吹至近干，應用60%甲醇-水 溶液定容至1 mL，渦旋混勻1 min，上機測定。按照液相色譜-串聯質譜條件測定樣品和標準工作溶液，樣品中待測物質的保留時間與標準溶液中待測物質的保留時間偏差在±2.5%。定量測定時采用標準曲線法測定，定性是應與濃度相當標準工作溶液的相對峰度一致。

2 結果與分析

2.1 質譜條件和色譜條件優化

質譜條件優化：4 種目標化合物響應值具有差異性，配制100 ng·mL-1目標物溶液，流動注射三通進樣方式在正離子模式下進行母離子全掃描，設置碰撞電壓1 eV，調節錐孔電壓使準分子離子峰的響應值最大，當椎體電壓為30 V 時氯霉素和氟甲砜霉素產生的準分子離子[M+H]+并分別為m/z192、m/z202，響應值最高。當碰撞電壓為18 eV 時，甲砜霉素可產生子離子m/z160。

色譜條件優化：根據試樣中被測樣液的含量情況，選取待測物的響應值在一定線性相應范圍內的濃度進行測定。在1.2.3 色譜條件下氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素參考保留時間分別為6.1 min、4.9 min、4.5 min。 各個目標化合物分離良好，且色譜峰峰型良好。

2.2 線性范圍

測得目標化合物在1.0 ～100 ng·mL-1呈現良好的線性關系，線性方程為y=6 878.82x，相關系數r ≥0.992 9。

2.3 精密度測定結果

如表2 所示，對質量濃度為10.0 ng·mL-1的3 種目標物標準溶液，開展6 次重復測定，測得結果相對標準偏差為0.4%～2.3%，說明儀器具備良好精密度。

表2 精密度測定結果表

2.4 樣品測定結果

如表3 所示，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素測定低限為0.1 μg·kg-1。本次方法中檢出值為0.3 μg·kg-1，低于標準方法檢測低限、檢測限（SN/T 2289—2009），氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素測定低限均為0.5 μg·kg-1；表明上述方式靈敏度高。

表3 樣品測定結果表

3 結論

超高效相色譜-串聯質譜法特點為高效、快速，為食品安全及質量檢測中開辟新的途徑。相較傳統高效液相色譜，采取更小微粒柱填充材料及較高泵壓，分離效果更為顯著[5]。研究結果表明，目標化合物在1.0 ～100 ng·mL-1呈現良好的線性關系，線性方程為y=6 878.82x，相關系數r ≥0.992 9。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素測定低限為0.1 μg·kg-1。精密度測定，相對標準偏差0.4%～2.3%，說明方法具備良好的精密度。本次方法中，氯霉素類藥物檢出值為0.3 μg·kg-1，低于標準方法檢測低限、檢測限。綜上，超高效相色譜-串 聯質譜法簡單、快捷、靈敏度高，可滿足食品及保健食品市場監管及檢驗需求。