氣相色譜-三重四極桿質譜法測定水產暫養水中丁香酚和異丁香酚

◎ 劉朋宇

（沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110022）

隨著人們對高品質生活的追求，鮮活水產品成為購買水產品的首選。在水產品的運輸和批發過程中，使用麻醉劑可有效地抑制其過激反應，從而降低物理傷害、減少微生物感染率和維持個體重量。常用的水產品麻醉劑有二氧化碳、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）和丁香酚類化合物[1-2]，其中丁香酚和異丁香酚具有價格低廉、麻醉效果好和代謝時間短的特點，近年被廣泛應用于水產品的運輸和暫養。各國對丁香酚和異丁香酚的監管條例各不相同，其中澳大利亞、日本、智利等國將丁香酚類化合物列為合法的水產品麻醉劑，而出于其存在致癌風險，美國食品藥品管理局禁止在水產品中使用丁香酚類化合物作為麻醉劑[3]。我國目前對丁香酚類化合物在水產品的運輸和暫養過程中的使用量和殘留量沒有相應的規定。

丁香酚（Eugenol），化學式為C10H12O2，是無色或淡黃色液體，異丁香酚（Isoeugenol），分子式是C10H12O2，淡黃色微稠厚液體，為丁香酚的同分異構體。目前，測定水產品和暫養水中丁香酚類化合物的方法主要有氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-6]、氣質聯用法[7-9]和液質聯用法[10-12]，其中氣相色譜法和液相色譜法的前處理中存在操作復雜、耗費試劑量大、干擾物難以去除和靈敏度低等缺點。由于丁香酚和異丁香酚為同分異構體，增加了液相色譜質譜法對其分離、確證和結果定量的難度[13]。本實驗選用氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀測定丁香酚和異丁香酚，能夠有效縮短前處理時間、提高效率、減少溶劑使用及降低環境污染，適用于批量檢測暫養水中丁香酚和異丁香酚化合物。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

水產暫養水，來源于超市、農貿市場和飯店，裝于塑料密封瓶中，放于-18 ℃冰箱中保存，待用。

丁香酚、異丁香酚，純度均≥98%；正己烷、乙 腈，均為色譜純；氯化鈉，為分析純。

8890-7000D 氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（美國安捷倫公司）、MV5 氮吹儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）、MS3 渦旋混合器（德國IKA 公司）及H1750 離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、Quintix224-1CN 電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液和試劑的配制

丁香酚和異丁香酚標準溶液：準確稱取丁香酚和異丁香酚純品各100 mg 于兩個100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。分別移取上述溶液用乙腈按照使用需求配制成混合標準工作液。

1.2.2 前處理方法

取暫養水樣品，常溫解凍，稱取10.0 g試樣于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 正己烷飽和的乙腈，5 g氯化鈉，2 000 r·min-1振蕩10 min，4 000 r·min-1離心 4 min，加入乙腈飽和的正己烷，手動振搖1 min， 4 000 r·min-1離心4 min，棄去上層正己烷相，取5 mL乙腈于試管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，渦旋混合1 min。過0.45 μm 有機濾膜于1.5 mL 樣品瓶中，待測定。

1.2.3 氣相色譜-質譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：DB-1701（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；升溫程序：100 ℃保持1 min，6 ℃·min-1升至200 ℃，25 ℃·min-1升至260 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣，流速1 mL·min-1；進樣口溫度：230 ℃，進樣方式：不分流進樣，進樣量1 μL[7]。

（2）質譜條件。離子源：電子轟擊電離源（EI）；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲10 min；碰撞氣：氮氣1.5 mL·min-1，淬滅氣：氦氣2.25 mL·min-1。采集方式：多反應監測（MRM）模式，離子監測參數見表1。

表1 丁香酚和異丁香酚MRM 采集條件表

2 結果與分析

2.1 丁香酚和異丁香酚的質譜分析

通過在暫養水中添加丁香酚和異丁香酚，樣品經1.2.2 方法處理，采用選擇離子掃描（SIM）模式進行測定，結果發現樣品中存在較多的干擾物，峰面積與待測組分部分重合，導致無法準確定性和定量，加標樣品SIM 色譜圖見圖1。

通過多反應監測MRM 條件的建立和測定，可有效排除干擾物質對異丁香酚的影響。通過產物離子掃描和更改碰撞電壓，確定兩者的MRM 采集條件，其中m/z=149 響應值高于m/z=131，但由于m/z=149 存在干擾離子，故選擇m/z=131 為定量離子，與翟紋靜等人的研究結果一致[14]。加標樣品的總離子流（TIC）圖和MRM 色譜圖見圖2。

圖1 添加50 μg·kg-1 丁香酚和異丁香酚樣品SIM 色譜圖

圖2 加標樣品中丁香酚和異丁香酚的TIC 色譜圖和MRM 色譜圖

2.2 提取凈化

暫養水成分相對簡單，根據丁香酚和異丁香酚的極性，將其提取至乙腈中，添加氯化鈉鹽析，使水中的丁香酚和異丁香酚更充分地轉移至乙腈相，乙腈用正己烷飽和，可有效的減少樣品中非極性成分的溶解，同時采用正己烷凈化，可將水相和乙腈相中的低極性成分分離，起到凈化的作用。

2.3 方法的檢測限和定量限

將丁香酚和異丁香酚配制成20 μg·L-1、40 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和500 μg·L-1混合標準工作液。在1.2.3 條件下測定，以濃度為橫坐標、定量離子峰面積為縱坐標，得丁香酚的線性方程為：y=52.665 763x-746.691 700，相關系數r=0.997 8：異丁香酚的線性方程為：y=33.295 797x-768.763 021，相關系數r=0.997 6，結果表明，在20 ～500 μg·L-1濃度范圍內，兩個化合物的線性關系良好。通過在水樣中添加10 μg·kg-1丁香酚和異丁香酚，經前處理和測定，MRM 色譜圖見圖3。按照3 倍信噪比為檢出限，10 倍信噪比為定量限，計算得丁香酚和異丁香酚的檢出限均為2 μg·kg-1，定量限均為5 μg·kg-1。

2.4 加標回收率和精密度

為了驗證方法的準確性和可靠性，在空白水樣中添加3 個濃度水平的丁香酚和異丁香酚，每個水平添加6 個平行樣，經過樣品前處理和測定，加標回收率和精密度（RSD）結果見表2。

2.5 實際樣品測定

采用本方法對20 份水產暫養水進行處理和測定，其中3 份樣品檢出丁香酚，檢出范圍12 ～55 μg·kg-1，檢出最高值為鯉魚暫養用水，異丁香酚均未檢出。

圖3 樣品中添加10 μg·kg-1 的MRM 色譜圖

表2 丁香酚和異丁香酚回收率和精密度表

3 結論

通過對現有前處理和測定方法的優化，本研究建立了測定水產暫養水中丁香酚和異丁香酚殘留量的氣相色譜-三重四極桿質譜法。相較單級質譜方法，本方法可以有效的去除樣品中存在的干擾物質對測定結果的影響，提高了檢測的靈敏度，通過測定暫養水中丁香酚和異丁香酚的殘留量，即可反應其在水產品中的使用情況，可減少水產品的樣本數量、降低操作難度。該方法前處理簡單、靈敏度高、抗干擾能力強，適用于快速批量測定暫養水及養殖用水中丁香酚和異丁香酚的殘留量。