基于GC-MS 技術對鉤吻堿食物中毒的應急檢測

◎ 馮 濤，陶 森，阮世勇，黎 獻，林對儉

（陽江市檢測檢驗中心，廣東 陽江 529500）

鉤吻（Geisemium elegans）是馬錢科（Loganiaceae）葫蔓藤屬（Geisemium）植物[1]，為有毒中藥，古人形容其毒性猛烈“入口即鉤人喉吻”，故取名“鉤吻”，又稱“斷腸草”“大茶藥”，主要分布在東南亞國家和我國的南部地區(qū)（如福建、廣東、廣西等地）。鉤吻花、葉、根、莖均有劇毒，根部毒性最強。作為帶毒中藥多外用以治療皮膚病、風濕、消腫止痛[2]。鉤吻藥性和毒性均來自于鉤吻堿，研究表明鉤吻堿具有抗腫瘤、抗焦慮、消炎鎮(zhèn)痛、促食欲的作用[3]，對肝臟、腎臟、睪丸和神經(jīng)中樞系統(tǒng)都有嚴重的毒性作用，能透過血腦屏障，在腦中的消除速度相對較慢，具有很強的神經(jīng)毒性[4]。中毒癥狀主要為口渴、流涎、惡心、嘔吐、抽搐、肌肉無力、四肢麻木、煩躁不安、心律失常、頭暈和呼吸困難等[5]。鉤吻藥用起效劑量同中毒劑量相近[6]，常因誤食及使用不當引起中毒事件。而廣東陽江民間有使用鉤吻根煲湯的飲食習慣，時有劑量掌握不當造成食物中毒，是該地區(qū)的高風險食物中毒因子，近5 年來已發(fā)生4 起鉤吻堿中毒事件。因此，在該區(qū)域研究和開展鉤吻堿應急檢測工作極為必要，對保障該區(qū)域食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

島津GCMS-TQ8050 氣相色譜串聯(lián)三級四極桿質譜聯(lián)用儀（配備EI 源，日本Shimadzu 公司）； KQ-250DV 超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MS3 型漩渦振蕩器（德國IKA 公司）；sigma3-18ks高速冷凍離心機（德國sigma 公司）；TruboVap Ⅱ型吹氮濃縮儀（美國Caliper 公司）；0.22 μm 有機系針筒式微孔濾膜過濾器（上海ANPLE 公司）。

1.1.2 試劑

丙酮、正己烷（色譜純，德國Merck 公司）；氫氧化鈉和無水硫酸鈉為分析純；標準品鉤吻堿（純度99.0%），分子式C20H22N2O2，分子量322，美國Sigma 公司。

樣品：患者血液1、患者血液2、洗胃液1、洗胃液2、嘔吐物1 及患者家中采集的未食用完的食物：鉤吻根豬腳湯、白切雞、燒鵝、炒白菜、炒菜心，共計10 份。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

將鉤吻堿標準物質配制成質量濃度為100 mg·L-1的標準儲備液，-20 ℃下保存。臨用前使用三氯甲烷梯度稀釋，配成質量濃度分別為0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

分別取5.00 g 樣品，各加入10 mL10%NaOH，超聲振蕩提取10 min，4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，加入5 mL 正己烷，振蕩5 min 進行液液萃取，4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾備用。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：進樣口溫度200 ℃；進樣量：1 μL，色譜柱為Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×100 mm，0.25 μm， 日本Shimadzu 公司），初始柱溫100 ℃，保持1 min， 以40 ℃ ·min-1升至280 ℃，保持 10 min；載氣為氦氣，恒定流速：1.2 L·min-1，不分流進樣模式。

質譜條件：接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電壓70 eV；采集時間2 ～25 min；全掃描模式（Scan）掃描范圍50 ～350 amu；選擇離子模式（SIM）采集特征碎片離子（m/z）108、279、322、251。

1.2.4 定性定量方式

采用氣相色譜-串聯(lián)質譜在Scan 模式下對樣品全掃描，所得數(shù)據(jù)使用Nist17 譜庫檢索定性；SIM 模式下依次測定標準溶液和樣品測試液，通過比較各特征碎片離子的豐度來進一步確證。鉤吻堿標準品各特征離子碎片豐度分別為：108（100%）、279（42%）、322（35%）、251（18%），并要求試樣中各離子的豐度不得超過標準的±20%。沒有標準物質時，可直接用譜庫檢索結果定性。

采用外標法定量，選擇m/z108 為定量離子[7]，以標準系列濃度為橫坐標，標準定量離子峰面積為縱坐標制作校正曲線，待測目標化合物定量離子峰面積與相應校正曲線比較定量，應急檢測中有時也采用單點外標法定量。

2 結果與分析

2.1 譜庫檢索結果

樣品在Scan 模式進行全掃描，發(fā)現(xiàn)鉤吻根豬腳湯、嘔吐物1、洗胃液1 三種樣品中有可疑峰，出峰時間為10.25 min，鉤吻根豬腳湯中峰面積最大，該可疑檢測數(shù)據(jù)進行Nist17 譜庫檢索，在湯和患者嘔吐物中發(fā)現(xiàn)鉤吻堿（相似度98%），鉤吻根豬腳湯樣品（圖1）中出現(xiàn)的4 個明顯的峰，依次命名為1 號～4 號峰，經(jīng)Nist17 譜庫檢索，3 號峰（圖2）為鉤吻堿，其他為香料物質等。

圖1 鉤吻根豬腳湯ScanTIC 圖

圖2 3 號峰Scan 質譜圖

在SIM 模 式（圖3）下 以m/z108、279、322、251 為監(jiān)測離子，依次進樣鉤吻堿標準物質和陽性樣品，進行二級離子確證，其出峰時間一致、離子豐度比一致，結合譜庫檢索結果及臨床癥狀可以確認鉤吻堿為本起食物中毒事件的中毒因子。SIM 模式僅監(jiān)測選定目標離子，能更好地排除基質和雜質的干擾。

圖3 樣品和標準品譜圖對比圖

2.2 定量結果

在SIM 模 式 下 以m/z 108、279、322、251 為 監(jiān)測離子，m/z108 為定量離子，依次進樣0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1的 鉤吻堿標準物質，以濃度為橫坐標峰面積為縱坐標進行一次線性擬合，繪制標準曲線，一次線性方程為：Y=106 808.5X+12 421.96，R2=0.999 8；線性良好；滿足定量要求。在相同儀器條件下對樣品進行測定，使用LabSolution 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對檢測結果處理。樣品定量結果見表1。患者嘔吐物、洗胃液、鉤吻根豬腳湯中均檢出鉤吻堿，其中鉤吻根豬腳湯中含量最高為6.780 mg·kg-1，而鉤吻堿大鼠腹腔注射半數(shù)致死劑量（LD50）為1.2 mg·kg-1[8]，湯中的鉤吻堿含量遠超中毒劑量，可以判定患者是食用了鉤吻豬腳湯導致的鉤吻堿中毒。鉤吻堿毒性強，致死劑量低，中毒病亡率高達47.6%。有報道稱鉤吻根3 g 左右、嫩芽7 個、流浸膏3.5 ～5.0 mL 或鉤吻堿0.15 ～0.30 g 即可致死。

表1 GC-MS 檢測結果表

3 討論與結論

目前，鉤吻堿檢測方法有氣相色譜法（GC）[9-10]、 高效液相色譜法（HPLC）[11-12]、氣相色譜- 質譜聯(lián)用法（GC-MS）[13]、高效液相色譜-質譜聯(lián)用法 （HPLC-MS/MS）[14-15]。GC、HPLC 靈敏度低、僅依據(jù)保留時間定性，需要標準物質做參比，遇到結構相似的物質難以分離、定性能力弱不適用于食物中毒的應急檢測；LC-MS/MS 有較高的靈敏度、準確的定性能力和高速的分析效率是鉤吻堿常見的檢測方法，但三重四級桿質譜儀不能配制標準譜庫，不具備未知檢測目標的檢索能力，定性能力對標準品依賴較高，在應急檢測工作中具有很大的局限性。GC-MS 分析效率、靈敏度、準確度同LC-MS/MS 相當，可配備Nist 17 質譜庫（210 000 余種化合物，240 000 余張譜圖）和Wiley 質譜庫（300 000 余種化合物，400 000 余張譜圖）[16]，等多種標準譜庫，基本涵蓋了常見揮發(fā)性毒物，可進行譜庫檢索定性，二級質譜圖確證，具有無需標準品即可定性和定性準確的優(yōu)勢，適合食物中毒應急檢測的需要。鉤吻堿本身是堿性物質根據(jù)相似相溶原理，堿性溶液提取率較高，報道中多使用堿性溶液浸提、醇溶液提取、或酸性溶液提取后調節(jié)pH至堿性后采用有機溶劑提取[17-18]。水作為提取溶劑低廉、無毒、易得，但提取效率低，提取液不能直接用于GC-MS 測定；酸可以和生物堿反應形成鹽，同時沉淀酸不溶性物質，但由于鹽的特性提取純度不高，且不易分離；生物堿多可溶于醇和三氯甲烷，且三氯甲烷提取效率較高，考慮氯仿直接提取時雜質含量較高，一般采取先使用堿性溶液提取，再使用三氯甲烷萃取的方法。考慮到應急檢測的時效性和GC-MS特性，本次應急檢測使用10%NaOH 溶液提取，三氯甲烷液液萃取，過0.22 μm 微孔濾膜后，使用氣質Scan 模式全掃描Nist17 譜庫檢索定性，比對標準物質全掃描質譜圖進行確證，使用SIM 模式進行定量，該方法前處理過程簡單高效，定性定量準確。GC-MS 作為精密貴重儀器，多配備在市級以上實驗室，而鉤吻堿中毒事件多發(fā)于欠發(fā)達山區(qū)，若當?shù)貦z測機構可能未配備這類儀器設備， 可利用相對簡易的儀器開展鉤吻堿中毒的定性實驗，如薄層色譜（TLC）法[19-20]、特異顯色反應法[21]等也能在此類應急檢測中發(fā)揮相應作用。

氣質聯(lián)用儀SIM 模式下的選擇性離子掃描有效降低復雜基質對檢測結果的干擾，對樣本的凈化程度依賴低，有效縮短前處理時間。Scan 模式下可通過標準譜庫檢索實現(xiàn)危害因子的精準識別，定性能力不依賴標準品。應用于中毒樣品中鉤吻堿的檢測具有高效準確的特性，能應對食物中毒的突發(fā)性和檢測目標的不確定性，滿足應急檢測速度快、靈敏度高、準確度高的要求。