土雞蛋中添加劑斑蝥黃的色譜 質譜聯用檢測方法研究

◎ 陳庚超，葉李揚，黃智娟，李星穎，劉起文

（1.黃埔海關技術中心，廣東 東莞 523000；2.東莞理工學院，廣東 東莞 523808）

近年來，出現了斑蝥黃添加劑被用于蛋雞養殖，以加深雞蛋蛋黃顏色，商家打著“土雞蛋”“柴雞蛋”“草雞蛋”等不符合實際的名號抬高雞蛋價格、欺騙消費者的事件[1]。“斑蝥黃”又被稱為角黃素（Canthaxanthin，分子式C40H52O2，CAS 號：514-78-3），斑蝥黃是貝殼類、部分魚類、水藻類等生物體內能夠自然代謝生成的類胡蘿卜素物質[2]。斑蝥黃常規條件下顯橙紅色，同時由于其具有較好的穩定性，可用于加工類食品，如肉制品、調味料等食物的調色工藝中，也可應用于養殖業中，起到使雞蛋的蛋黃顏色更鮮紅、使動物鮮肉的色澤更顯紅潤等效果[3]。斑蝥黃之所以能在畜禽養殖中發揮著很好的作用，是因為它具有以下基礎優點。①均勻分布性。斑蝥黃中的活性成分角黃素能夠均勻地分布在淀粉包膜的明膠和碳水化合物中，成為球形或串珠狀的小顆粒，這種獨特的性能確保了斑蝥黃的穩定性和成品極佳的均勻分布性。②較強的穩定性。斑蝥黃的穩定特性增強了角黃素對抗外界不利因素及耐受苛刻加工條件的能力，使其能夠應用于養殖業和食品加工業中。③溶解性。角黃素能夠溶解在多種溶劑中形成均一穩定分散體系，因此在禽用飼料中極易被混合，且分布均勻[4]，因此可以較為廣泛地應用于養殖業和食品加工業中。本文利用操作簡便的液液萃取凈化方法結合超高效液相色-質譜/質譜聯用儀建立了準確、高效、及時和科學的檢測方法，這對于土雞蛋等農產品安全的檢測監管具有重要的 現實意義。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

Preminer+Acquity 超高效液相色-質譜/質譜聯用儀（美國Waters公司）、多功能臺式高速離心機（Thermo Scientific 公司）、MS304TS/02 電子天平（梅特勒-托利多公司）、AVANT 超聲波清洗器（WIGGENS 儀器公司）、FE28 pH 計（梅特勒-托利多儀器公司）及Milli-Q IQ7000 超純水機（默克化工公司）。

1.2 試劑耗材

斑蝥黃標準品，CAS 號：514-78-3，純度大于99%。甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（分析純）、乙酸（分析純）、乙酸銨（分析純）、丙酮（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）及氨水（分析純）。本文中涉及使用的實驗用水除特殊說明外均為超純水。

1.3 目標化合物標準溶液的配制

稱取斑蝥黃標準品適量于容量瓶中，甲醇做溶劑配制成1 000 mg·L-1的標準儲備液溶液，于4℃避光保存。吸取適量斑蝥黃標準儲備液用甲醇做溶劑配制成濃度為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的系列標準工作溶液。

1.4 樣品前處理實驗

取具有代表性的生雞蛋約500g 煮熟，冷卻后剝殼，用高速組織搗碎機充分搗碎、混勻。

準確稱取該類樣品5.00 g 于50 mL 離心管中，準確加入20 mL 乙腈并渦旋1 min 后再超聲提取30 min； 然后在10 000 r·min-1充分離心5 min。取5 mL 上述離心上清液，加入5 mL 正己烷，渦旋1 min 后充分離心5 min，取約1.00 mL 下層澄清的萃取溶液過0.22 μm孔徑的有機濾膜后，待上機測試[5]。

1.5 儀器條件的優化

1.5.1 超高效液相色譜儀器條件的優化

在液相色譜的儀器方法優化過程中，流動相非常重要，實驗室論證了多種流動相，如超純水、0.1%的甲酸水溶液、0.2 mmol·L-1的醋酸銨水溶液作為水相和以甲醇、乙腈作為有機相的多種不同組合作為流動相來進行分析測試比較，設置了不同梯度洗脫程序的儀器條件進行分析測試[6]，在充分的實驗后比較目標化合物峰形和峰面積，最終得出了以0.1%的甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液作為最佳的液相色譜儀器條件。

具體超高效液相色譜條件：Waters 分析色譜柱UPLC BEH C18（規格為2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液；超高效液相梯度洗脫程序見表1，流速為0.30 mL·min-1[7]。

表1 超高效液相梯度洗脫程序表

1.5.2 三重四極桿質譜參數的優化

將斑蝥黃標準工作液注入儀器，經多次優化各個參數，使之達到最佳檢測出峰效果。理想的儀器參數為電噴霧電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔反吹氣流量：65 L·h-1；脫溶劑氣溫度：300 ℃；脫溶劑氣流量：650 L·h-1；碰撞氣流量：0.10 mL·min-1。

需要用到的高純氮可使用高純液氮或能提供等效氣體的氣體發生器，儀器設備使用前應調節各氣體流量等條件以使質譜靈敏度、分辨率達到最佳檢測需求[7]。模式選擇：電噴霧ESI+、MRM 模式，詳細質譜參數設置見表2[8]。

表2 斑蝥黃化合物質譜參數信息表

2 結果與分析

2.1 結果計算和表述

本方法按標準曲線外標法定量，按式（1）計算樣品中斑蝥黃殘留量。計算結果需扣除空白值。

式（1）中，W-樣品中目標化合物殘留量，單位為 μg·kg-1；C-斑蝥黃的儀器上機濃度，單位為μg·L-1； V-溶劑提取液總體積，單位為mL；M-實驗中稱取樣品質量，單位為g。

2.2 斑蝥黃線性范圍

本實驗配制標準溶液濃度為10 ng·mL-1、 20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的標準工作溶液濃度系列，按實驗過程中確定的方法經超高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀分析測試后，建立擬合曲線。結果顯示，目標化合物斑蝥黃的線性相關系數即R2≥0.99，結果符合實驗室開展相關檢測的實驗要求，本方法的線性定量范圍為10 ～200 ng·mL-1。

斑蝥黃標準工作溶液理想色譜圖，如圖1 中所示。

圖1 10 ng·mL-1 的斑蝥黃標準品的色譜圖

2.3 目標化合物檢出限計算

采用1.00 ng·mL-1標準溶液色譜圖，根據參考公式LOD=3S/N（信噪比）來計算檢出限[9]，確定本方法斑蝥黃的檢出限5.00 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1。

2.4 精密度、回收率等參數的實驗分析

準備制備好的不含有斑蝥黃色素的雞蛋樣品，稱取樣品約5.00 g 共計20 份，選取其中2份作為對照實驗樣品，剩余的18 份樣品平均分成3 組，按“3水平添加6平行實驗”的原則進行目標化合物添加回收實驗，按本文所述的前處理實驗進行目標化合物的提取分離，制成10 μg·kg-1、20 μg·kg-1和100 μg·kg-1的3 組不同濃度的樣品回收率試驗[10]，10 ng·mL-1樣品加標色譜圖見圖2。最后分析數據結果顯示平均回收率均在85%～105%、精密度RSD ≤5（n=6），具體結果的回收率和精密度參數見表3[11]。

圖2 10 ng·mL-1 的斑蝥黃的樣品加標色譜圖

表3 加標回收率和結果精密度表（n=6）

3 結論

本文建立了以液液萃取凈化樣品的前處理方法，使用超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜聯用儀對土雞蛋中添加劑斑蝥黃進行了分析測試，最后取得了較好的實驗結果。結果表明，該方法具有前處理簡單、提取效率較高、操作快捷方便等優點，還具有定性定量準確、靈敏度高等特點。本實驗的分析方法提高了雞蛋中添加劑斑蝥黃的檢測技術水平，可以為市場監管提供較強的技術支撐。