水果發(fā)酵液中甲醇含量的測定分析

◎ 楊 瀟，周 唯，張 燕

（1.合肥師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074）

在發(fā)展中國家，水果由于高產(chǎn)以及缺乏適當(dāng)?shù)谋４婧瓦\(yùn)輸方法，常常產(chǎn)生大量的固體廢棄物[1]。這些水果處理中的廢棄物大多來自家庭廚房和食品工業(yè)[2]，且此類固體廢棄物包含大量有機(jī)物質(zhì)[3]，采用傳統(tǒng)處理方法處理會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染和健康威脅。從環(huán)保的角度出發(fā)，人們需要發(fā)展合適的新廢棄物處理技術(shù)以更好地利用有機(jī)垃圾，減少其污染[4-6]。有機(jī)食品廢棄物的特點(diǎn)是具有化學(xué)復(fù)雜性、易降解性、高含水量及富含營養(yǎng)物[7]，這就使其可以通過發(fā)酵生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。全球?qū)τ趶挠袡C(jī)廢棄物中獲得生化產(chǎn)品的技術(shù)發(fā)展關(guān)注正與日俱增[8]。

水果和水果垃圾發(fā)酵原液，又稱為酵素，是由水果或其果渣、果皮等通過與糖、水混合發(fā)酵的產(chǎn)物[9]。取材于新鮮水果的發(fā)酵原液完整保留了水果中的有益營養(yǎng)成分，能夠長期保存，避免了新鮮水果在自然環(huán)境中的腐敗變質(zhì)而引起的環(huán)境污染。而取材于水果處理廢棄物的發(fā)酵原液，也稱為垃圾酵素，是一種多功能無毒殺菌清潔劑，能夠凈化空氣，改善環(huán)境，可用于有機(jī)農(nóng)業(yè)等環(huán)保事業(yè)中。因此，發(fā)酵原液的制備和利用能有效促進(jìn)有機(jī)固體廢棄物的循環(huán)利用。

制備發(fā)酵原液的過程中往往伴有醇類的產(chǎn)生。其中，甲醇對人體的傷害很大，通常在口服甲醇8 ～36 h 后人體就可產(chǎn)生頭痛、頭暈、乏力等癥狀，甚至痙攣，昏迷，死亡等[10]，即使少量甲醇也能引起慢性中毒[11-13]。因此，在發(fā)酵原液的發(fā)酵過程中，需要監(jiān)測甲醇的含量，以確保發(fā)酵原液在食用和使用上的安全性。

甲醇的檢測方法有很多，如分光光度法、色譜法等[14]。分光光度法是利用物質(zhì)的分子或離子對特定波長光的選擇吸收作用，對物質(zhì)進(jìn)行定性、定量及結(jié)構(gòu)分析。此法因操作簡單、效率高、選擇性好、靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度高等特性而得到廣泛應(yīng)用[15]。

到目前為止，對水果發(fā)酵原液發(fā)酵過程中甲醇含量變化的研究較少。基于此，本研究采用分光光度法[16]以品紅-亞硫酸法[14]測定水果發(fā)酵液中的甲醇含量。在前期研究中，筆者對甲醇含量的測定條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了發(fā)酵液中甲醇含量的測定條件如下[17]：吸收波長為590 nm，氧化時(shí)間10 min，顯色時(shí)間25 min。

研究分別用新鮮的蘋果（作為新鮮水果）和香蕉皮（水果垃圾）為原料，以紅糖、糖蜜和糖漿為糖原制備不同的發(fā)酵液。在為期3 個(gè)月的發(fā)酵過程中，對不同發(fā)酵液中的甲醇含量進(jìn)行測量，通過分析甲醇含量的變化，比較不同糖原對發(fā)酵過程的影響，為選擇最適合的糖原提供理論依據(jù)。同時(shí)，確定發(fā)酵原液的安全性，為水果發(fā)酵原液的應(yīng)用和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 原料

蘋果、香蕉皮、糖蜜、糖漿、紅糖和礦泉水（市售）。

1.1.2 試劑

高錳酸鉀（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、磷酸（85.0%，西隴科學(xué)股份有限公司）、草酸（AR，西隴科學(xué)股份有限公司）、硫酸（95.0%～98.0%，西隴科學(xué)股份有限公司）、堿性品紅（AR，天津市津北精細(xì)化工有限公司）、亞硫酸鈉（AR，西隴化工股份有限公司）、鹽酸（36.0%～38.0%，西隴科學(xué)股份有限公司）、甲醇（AR，上海振興化工一廠）、無水乙醇（AR，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）、蒸餾水（AR，北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所）和活性炭 （AR，天津市登科化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

721 型系列可見光分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、79HW-1 恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇市金城國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠）和分析天平（舜宇恒平儀器）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

高錳酸鉀-磷酸溶液：準(zhǔn)確稱取3 g 高錳酸鉀，加入15 mL 85%磷酸溶液及70 mL 水的混合液中，待高錳酸鉀充分溶解后用水定容至100 mL；草酸-硫酸溶液：準(zhǔn)確稱取5 g 無水草酸（H2C2O4），按照（1 ∶1）的比例溶于硫酸中，定容至100 mL；品紅-亞硫酸溶液：稱取0.l g 堿性品紅，仔細(xì)研磨后加水（80 ℃） 60 mL，邊加水邊研磨使其溶解，待其充分溶解后吸取上清液濾于100 mL容量瓶中，冷卻后加10 mL（10%）亞硫酸鈉溶液，1 mL 鹽酸，定容至100 mL，放置過夜；甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1.000 g 甲醇（相當(dāng)于1.27 mL）置于預(yù)先裝有少量蒸餾水的100 mL 容量瓶中，定容至100 mL。此溶液甲醇濃度10 g·L-1；甲醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：吸取10 mL 甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液置于100 mL 容量瓶中，定容，此溶液甲醇含量1 g·L-1；60%無甲醇無甲醛的乙醇：取300 mL 無水乙醇，加高錳酸鉀少許，振搖后放置24 h，蒸餾，最初和最后的1／10 蒸餾液棄去，收集中間的蒸餾部分即可；10%亞硫酸鈉溶液：稱10 g 亞硫酸鈉固體，溶于90 mL 的蒸餾水中。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

（1）用移液管精確吸取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 甲醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（相當(dāng)于0 mg、0.2 mg、0.4 mg、0.6 mg、0.8 mg 和1.0 mg 甲醇）分別置于25 mL 具塞比色管中，各加入0.5 mL 60%無甲醇無甲醛的乙醇。

（2）于標(biāo)準(zhǔn)管中各加水至5 mL，混勻，各管依次加入2 mL 高錳酸鉀-磷酸溶液，混勻，氧化時(shí)間為10 min（自加第一管始計(jì)時(shí)）。

（3）各管加2 mL 草酸-硫酸溶液（自加第一管起每管間隔30 s），混勻后靜置，使溶液褪色，放置15 min（自加第一管始計(jì)時(shí)）。

（4）立即依次加入5 mL 品紅亞硫酸溶液，每管間隔30 s，混勻，于20 ℃以上靜置，靜置時(shí)間為25 min （自加第一管始計(jì)時(shí)）。

（5）用2 cm 比色杯，以零管調(diào)零點(diǎn)，于590 nm處測吸光度（每管間隔1 min）。

（6）記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。1.2.3 發(fā)酵原液的制備

（1）準(zhǔn)備好材料：水果（蘋果和香蕉皮）、水、糖原（紅糖、糖漿、糖蜜）。

（2）將水果∶糖原∶水分別按照質(zhì)量比3 ∶1 ∶10 的比例放入發(fā)酵罐中，并蓋好發(fā)酵罐蓋，保證罐內(nèi)是一個(gè)密封的環(huán)境，以利于發(fā)酵的進(jìn)行。

1.2.4 發(fā)酵液中甲醇含量的測定

取1 mL 待測液于25 mL 具塞比色管中，然后加水至5 mL，混勻后加入2 mL 高錳酸鉀-磷酸溶液，混勻，靜置，放置時(shí)間10 min。然后加入2 mL 草酸- 硫 酸溶液，混勻后靜置，使溶液褪色，放置15 min。再立即加入5 mL 品紅亞硫酸溶液，混勻，于20 ℃靜置。靜置顯色時(shí)間25 min。用2 cm 比色杯，以零管調(diào)零點(diǎn)，于590 nm 處測吸光度。將待測液測得的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。在發(fā)酵過程中，按照上述方法每10 d 測量一次發(fā)酵液中甲醇的含量。整個(gè)測定過程時(shí)間為100 d。

2 結(jié)果與分析

品紅-亞硫酸法[18]是應(yīng)用于糧食發(fā)酵釀酒中測定甲醇的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，酒精發(fā)酵過程與水果發(fā)酵過程有著類似之處，因此，研究采用品紅-亞硫酸法測定發(fā)酵液中的甲醇含量。

2.1 甲醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)實(shí)驗(yàn)1.2.2 對標(biāo)準(zhǔn)含量甲醇樣品溶液進(jìn)行甲醇含量測定，得到甲醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 甲醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖1 可知，在0 ～1.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與甲醇含量成正比，其線性方程為：y=0.072x+0.024，即：A=0.072c+0.024。其中，c 為甲醇濃度，單位為mg·mL-1，A 為吸光度，單位是Abs。相干系數(shù)R2=0.992 6，偏差較小，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程可用于甲醇含量的測定計(jì)算。

2.2 發(fā)酵過程中甲醇含量的變化

在發(fā)酵液的原料選擇上，研究選用了日常生活中較為常見的蘋果作為水果食用酵素的原料，由于制備的蘋果發(fā)酵液以食用為主，在糖原的選擇上，選用了紅糖、糖蜜和果葡糖漿。研究選用香蕉皮作為水果垃圾酵素的原料，香蕉皮發(fā)酵液以日常生活使用為主（非食用），因此，研究選用紅糖和糖蜜制備香蕉皮發(fā)酵液的原料。

由實(shí)驗(yàn)1.2.4，對不同發(fā)酵液進(jìn)行甲醇含量的測定，時(shí)間為100 d，每間隔10 d 進(jìn)行一次甲醇含量測定。由測得的吸光度根據(jù)甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線得到甲醇的相應(yīng)含量，測定結(jié)果如圖2 ～圖6 所示。

如圖2 所示，香蕉皮紅糖發(fā)酵原液中，甲醇含量從第10 d 開始下降，第30 d 后有所上升，40 ～50 d變化不明顯。第50 d 后增加，第70 d 甲醇含量達(dá)到峰值。80 d 之后甲醇含量持續(xù)下降至接近為0 mg·mL-1。這一變化主要與香蕉皮的成分及其發(fā)酵過程有關(guān)。香蕉皮中除水分外，主要含有糖類、少量蛋白質(zhì)、脂肪、酚類、維生素及礦物質(zhì)[19-20]。

圖2 香蕉皮紅糖發(fā)酵原液中甲醇含量與測量天數(shù)的關(guān)系圖

糖類物質(zhì)中，主要含有果膠、膳食纖維和多糖[21]，其中，果膠含量較高[22]，果膠質(zhì)是甲醇生成的基礎(chǔ)[23]。發(fā)酵前期，甲醇由香蕉皮自身所含少量果膠酶分解果膠產(chǎn)生[24-26]，甲醇含量在達(dá)到低峰值后逐漸降低。發(fā)酵30 d 后，香蕉皮逐步水解，香蕉皮自身所帶菌群微生物代謝產(chǎn)生果膠酶，且含量逐漸增加[27-28]，發(fā)酵產(chǎn)生的果膠酶進(jìn)一步分解香蕉皮中的果膠產(chǎn)生甲醇[25-26]。果膠質(zhì)分解加快使得甲醇含量增加并達(dá)到峰值。之后，果膠含量因分解逐漸下降，甲醇含量也持續(xù)下降至痕量。

如圖3 所示，香蕉皮糖蜜發(fā)酵液中的甲醇含量在40 d 左右就達(dá)到峰值，50 d 后略有起伏，之后下降至痕量。

圖3 香蕉皮糖蜜發(fā)酵原液甲醇含量與測量天數(shù)的關(guān)系圖

有所不同的是，香蕉皮糖蜜中甲醇含量的峰值時(shí)間較香蕉皮紅糖提前了30 d。兩種發(fā)酵液均由香蕉皮發(fā)酵。其發(fā)酵變化的不同可能是由于糖原的不同導(dǎo)致的。因?yàn)樘敲壑泻写罅康目砂l(fā)酵糖及發(fā)酵所需的生物素，是微生物進(jìn)行發(fā)酵的理想復(fù)合原料[29]。糖蜜的存在加速了香蕉皮發(fā)酵液中微生物的代謝，使大量果膠酶的產(chǎn)生時(shí)間提前，因此經(jīng)由果膠酶分解果膠得到的甲醇含量在第40 d 即達(dá)到峰值。值得注意的是，在第60 d，仍有一個(gè)甲醇含量的小高峰，這可能是由于糖蜜自帶雜菌引起的[30]，不同菌群的競爭使其代謝速度不同，在第50 d 后仍有少量菌群參與代謝產(chǎn)生少量果膠酶，引起甲醇含量的略微增加，并在第60 d 后持續(xù)下降。

如圖4 所示，蘋果紅糖發(fā)酵原液中甲醇含量在第10 d 即達(dá)到峰值，峰值出現(xiàn)時(shí)間早，之后呈波動(dòng)變化直至含量下降。與香蕉皮不同，在蘋果中所含有的可溶性糖、有機(jī)酸、酚類、維生素和礦物質(zhì)中[31-32]，可溶性糖含量較高，其中果糖含量最高，占可溶性糖的43.7%～55.7%[33]，較高的糖含量有利于微生物的代謝，使蘋果紅糖發(fā)酵液在發(fā)酵初期即經(jīng)由微生物代謝產(chǎn)生果膠酶，果膠酶分解蘋果中的果膠產(chǎn)生甲醇[34]，果膠酶含量的增加使得發(fā)酵液中的甲醇含量增加[35]，促使甲醇在第10 d 就達(dá)到峰值。不同峰值的波動(dòng)可能是由于不同菌群的代謝所致。70 d 以后，蘋果中果膠含量因分解而下降，使甲醇含量逐漸降低至微量。

圖4 蘋果紅糖發(fā)酵原液甲醇含量與測量天數(shù)的關(guān)系圖

如圖5 所示，蘋果糖蜜發(fā)酵原液中甲醇含量的變化與蘋果紅糖中的變化類似，呈現(xiàn)波動(dòng)的趨勢。所不同的是，蘋果糖蜜的甲醇含量峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚，在第40 d 左右。之后持續(xù)下降在60 d 達(dá)到低點(diǎn)，然后上升，到第70 d 達(dá)到第二峰值，之后下降并有微小波動(dòng)。主要原因可能是糖原的不同對發(fā)酵過程產(chǎn)生的影響。與紅糖相比，糖蜜對于以蘋果為原料的液體發(fā)酵似乎在前期有所抑制，甲醇含量在前30 d 并不高，這有可能是糖蜜中自帶的雜菌對蘋果自身微生物菌群代謝產(chǎn)生了抑制[26]。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，微生物代謝逐漸活躍，發(fā)酵產(chǎn)生果膠酶，在第40 d 時(shí)，在果膠酶的促進(jìn)下甲醇含量達(dá)到峰值[34]。在發(fā)酵90 d 后，甲醇含量仍有微小上升，說明蘋果糖蜜發(fā)酵液在90 d 后仍未完全穩(wěn)定。

圖5 蘋果糖蜜發(fā)酵原液甲醇含量與測量天數(shù)的關(guān)系圖

如圖6 所示，蘋果糖漿發(fā)酵原液中甲醇含量隨測量天數(shù)呈現(xiàn)波動(dòng)變化，其中在第70 d 左右甲醇含量達(dá)到最大值，之后持續(xù)下降。甲醇最大值出現(xiàn)時(shí)間比蘋果紅糖與蘋果糖蜜發(fā)酵液要晚，這是發(fā)酵基質(zhì)和糖漿共同作用的結(jié)果。由于糖漿的主要成分是葡萄糖和果糖，兩者都屬于單糖，能被酵母直接利用，發(fā)酵速度快，含量較高的單糖糖原參與發(fā)酵在一定程度上抑制了前期甲醇的大量產(chǎn)生[26,35]。發(fā)酵過程中，糖原的消耗以及不同菌群代謝，使甲醇含量呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，總糖濃度的降低促進(jìn)果膠酶的產(chǎn)生[26]，使甲醇含量在第70 d 達(dá)到峰值。而70 d 以后，發(fā)酵液中果膠質(zhì)含量的下降使甲醇生成量減少，甲醇含量逐漸降低。

圖6 蘋果糖漿發(fā)酵原液甲醇含量與測量天數(shù)的關(guān)系圖

2.3 不同發(fā)酵液的比較

由圖2 ～圖6 可知，5 種水果發(fā)酵液中的甲醇含量變化并不相同。以香蕉皮紅糖和蘋果紅糖發(fā)酵液為例（如圖2 和圖4 所示），在糖原相同的情況下，由于發(fā)酵基質(zhì)的不同，甲醇含量隨時(shí)間的變化趨勢有所不同，香蕉皮發(fā)酵過程中甲醇含量先升后降，蘋果發(fā)酵過程中甲醇含量呈波動(dòng)性變化。這主要是由于香蕉皮和蘋果的成分不同及其各自所帶菌種的不同引起的。

同時(shí)，不同糖原對發(fā)酵液的影響也不相同。由圖2 和圖3 可知，對于紅糖和糖蜜作為糖原的兩種香蕉皮發(fā)酵液，以糖蜜為糖原的發(fā)酵原液發(fā)酵速度較快，其中的甲醇含量也相對較低，因此，糖蜜適宜作為日用香蕉皮發(fā)酵液的糖原。

由圖4 ～圖6 可知，以紅糖、糖蜜和糖漿作為糖原的不同蘋果發(fā)酵液中，紅糖發(fā)酵液的發(fā)酵速度最快，糖蜜發(fā)酵液發(fā)酵速度最慢，糖漿發(fā)酵液發(fā)酵速度在前兩者之間。發(fā)酵100 d 時(shí)，蘋果糖漿發(fā)酵液的甲醇含量最低。因此，果葡糖漿作為食用蘋果發(fā)酵原液的糖原更為適用。

2.4 發(fā)酵液甲醇含量的安全性分析

圖7 為100 d 的發(fā)酵過程中，5 種發(fā)酵原液的甲醇含量最大值（以下簡稱為MMax）。其中香蕉皮糖蜜的MMax最低，其他4 種MMax值相當(dāng)。發(fā)酵過程中，5 種發(fā)酵液的MMax均不超過1 mg·mL-1。目前，我國對飲品中的甲醇含量沒有統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，甲醇含量最大量不能超過2 g·L-1（按100%酒精度折算），即2 mg·mL-1[36-37]。歐洲傳統(tǒng)果酒中甲醇的限定量在10 g·L-1[38]。圖7 中的橫線為我國甲醇限定量，如圖所示，5 種發(fā)酵原液的MMax均低于甲醇限定量，即在發(fā)酵過程中，甲醇含量始終低于甲醇限定量。因此，5 種發(fā)酵液在發(fā)酵過程中的甲醇含量都是安全對人體無害的。

圖7 5 種發(fā)酵原液甲醇含量最大值圖

圖8 是在發(fā)酵第90 d 和100 d 時(shí)的發(fā)酵液中的甲醇含量。如圖8 所示，發(fā)酵90 d 后不同發(fā)酵液中的甲醇含量均未超過0.2 mg·mL-1，遠(yuǎn)低于甲醇限量值 2 mg·mL-1。由此可知自釀發(fā)酵液發(fā)酵90 d 后的甲醇含量是安全的。

圖8 90 d 和100 d 時(shí)發(fā)酵液中甲醇含量圖

3 結(jié)論

本研究利用分光光度法以品紅-亞硫酸法測定水果發(fā)酵原液在100 d 發(fā)酵過程中甲醇含量的變化。由甲醇含量變化得出，對于香蕉皮制作的垃圾酵素，糖蜜適宜用作糖原。對于蘋果發(fā)酵液，果葡糖漿更適于作為糖原。蘋果發(fā)酵液發(fā)酵過程中甲醇含量的波動(dòng)性變化反映出蘋果自釀發(fā)酵液中多菌群存在的可能性，在后續(xù)研究中可以對其微生物組成作進(jìn)一步分析。

發(fā)酵過程中，5 種發(fā)酵液的甲醇含量均未超過國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限定量2 g·L-1，且發(fā)酵90 d 后均未超過0.2 mg·mL-1，因此可知這5 種發(fā)酵液的甲醇含量是安全的。蘋果及香蕉皮發(fā)酵液原料易得，有其獨(dú)特的食用和使用價(jià)值。發(fā)酵液的制備充分利用了水果廢棄物香蕉皮和食品工業(yè)副產(chǎn)物糖蜜，是真正減少排放，實(shí)現(xiàn)有機(jī)固體廢棄物綜合利用的環(huán)保途徑。