膠體金免疫層析法檢測(cè)牛奶中的環(huán)丙沙星殘留

◎ 王 麗

（昆山市食品質(zhì)量檢測(cè)中心，江蘇 昆山 215300）

恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR），是一種動(dòng)物專用抗生素，多用于奶牛養(yǎng)殖中部分疾病的預(yù)防以及治療[1]，然而在奶牛體內(nèi)由于有著較長(zhǎng)的半衰期，從而導(dǎo)致其在奶牛體內(nèi)代謝出環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）。據(jù)相關(guān)研究表明[2]，ENR 在奶牛體內(nèi)會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)就被代謝成為CIP，同時(shí)CIP 又會(huì)在奶牛分泌的乳液中存留較長(zhǎng)一段時(shí)間。本研究試圖借助膠體金免疫層析法（GICT）[3]來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中CIP 殘留的快速檢測(cè)，現(xiàn)將具體應(yīng)用過(guò)程分享如下，以供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市購(gòu)牛奶；自制環(huán)丙沙星抗血清；環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、依諾沙星（ENO）和氧氟沙星（OFL），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、氯金酸和羊抗兔IgG，均購(gòu)自安徽酷爾生物工程有限公司； N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和硝酸纖維素膜，均購(gòu)自瓦克化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XYZ3020 三維劃膜噴金儀（西寶生物科技股份有限公司）、DG-72AUTO 全自動(dòng)切條機(jī)（仙鋸金屬加工機(jī)械有限公司）、ZNCL-BS 智能數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）、DRP-9082 恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、imark 多功能酶標(biāo)儀（濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司）以及 TDL-5G 凍離心機(jī)（山東博科科學(xué)儀器）。

1.3 方法

1.3.1 制備環(huán)丙沙星包被抗原

稱取CIP（20.6 mg）溶于二甲亞砜（1 200 μL），再依次加入NHS（15.4 mg）和DCG（28.1 mg），室溫進(jìn)行5 h 的避光振蕩，標(biāo)記為A 液，于4 ℃環(huán)境下過(guò)夜。稱取OVA 10.0 mg 溶于2 mL 的NaHCO3溶液 （0.1 mol·L-1），標(biāo)記為B 液。取A 液上層清液逐滴加至B 液之中，期間于冰水混合物中對(duì)B 液不斷進(jìn)行振蕩，直至產(chǎn)生沉淀即可停止滴加。然后繼續(xù)2 h 以上的冰浴振蕩[4]，并于4 ℃條件下反應(yīng)過(guò)夜。將經(jīng)過(guò)過(guò)夜反應(yīng)的混合物轉(zhuǎn)移至透析袋中，使用pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖溶液（0.02 mol·L-1）予以透析，保持每日 3 次的換液頻率，持續(xù)透析3 d，完成透析以后于-20 ℃ 條件下保存等待后用。

1.3.2 制備環(huán)丙沙星抗體

借助Protein A-sephoarse 4B 親合層析柱[5]對(duì)CIP抗血清予以純化處理，借助磷酸鹽緩沖溶液透析3 d，最終獲得CIP 抗體。借助間接酶聯(lián)免疫分析對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定：使用pH 為9.6 的碳酸鹽包被緩沖液 （0.05 mol·L-1）包被抗原，使用磷酸鹽緩沖溶液對(duì)抗體予以倍比稀釋。當(dāng)OD 值為1.0 左右的時(shí)，抗體效價(jià)即為抗體稀釋倍數(shù)，視為最佳稀釋度。借助間接競(jìng)爭(zhēng)法[5]對(duì)抗體IC50值予以確定：標(biāo)準(zhǔn)品母液1 mg·mL-1，借助磷酸鹽緩沖溶液梯度稀釋至0.001 ng·mL-1、0.01 ng·mL-1、1 ng·mL-1、100 ng·mL-1、1000 ng·mL-1、10 000 ng·mL-1以及100 000 ng·mL-1，包被條件為10 μg·mL-1各孔100 μL，磷酸鹽緩沖溶液為空白對(duì)照開(kāi)展抑制試驗(yàn)，并建立抗體抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為抑制率，橫坐標(biāo)為CIP 濃度，對(duì)抗體IC50值予以確定。按照式（1）計(jì)算抑制率：

1.3.3 制備標(biāo)記材料

對(duì)氯化金三水合物（HAuCl4·3H2O）使用檸檬酸三鈉予以還原，使膠體金溶液得以制備出來(lái)[6]。然后于恒溫加熱磁力攪拌器進(jìn)行加熱以及攪拌，將3 mL的檸檬酸三鈉（1%）儲(chǔ)備液加進(jìn)沸騰的氯化金三水合物溶液（0.01%，100 mL），煮沸混合物5 min 并冷卻至室溫，定容至100 mL（加雙蒸水）。將最終獲得的膠體金溶液于4 ℃下儲(chǔ)存等待后用。

1.3.4 制備膠體金標(biāo)記抗體蛋白

借助磁力攪拌將抗體迅速加進(jìn)膠體金溶液（需要事先調(diào)節(jié)至合適pH），將混合物于室溫條件下進(jìn)行10 min 的攪拌，逐滴將20% BSA（20 μL）加入繼續(xù)進(jìn)行10 min 的攪拌，在9 000 r·min-1條件下將溶液離心50 min，用含有疊氮化鈉（0.03%）、Tri-ton-100（0.5%）、BSA（0.5%）和蔗糖（5%）的磷酸鹽緩沖液（0.02 mol·L-1）對(duì)沉淀物予以重懸。將制備好的溶液每孔5 μL 凍干于微孔板之中，然后于4 ℃下儲(chǔ)存等待后用[7]。

1.3.5 制備試紙條

使用磷酸鹽緩沖溶液稀釋羊抗兔IgG 和CIP 包被抗原至0.4 mg·mL-1、1 mg·mL-1，再經(jīng)硝酸纖維素膜以1 μL·cm-1包被作為T 線和C 線，然后于37 ℃條件下干燥1 h。將吸水紙、硝酸纖維素膜、樣品墊依次裝貼在PVC 膠板上，然后使用切條機(jī)將其切成4 mm 試紙條，并于干燥條件下避光保存等待后用[8]。

1.3.6 確定試紙條檢出限

使用標(biāo)品稀釋液分別配制濃度依次為25.00 ng·mL-1、12.50 ng·mL-1、6.25 ng·mL-1、3.12 ng·mL-1和1.56 ng·mL-1的CIP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液待用，吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液80 μL 于微孔板中進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)3 min 的孵育，隨后加樣，仔細(xì)觀察試紙條顯色情況，空白對(duì)照檢測(cè)線與檢測(cè)線顏色兩者之間差別明顯時(shí)的最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度即為試紙條的檢出限。

1.3.7 消除樣品基質(zhì)效應(yīng)

量取牛奶10 mL 移至離心管之中，選擇3 500 r·min-1進(jìn)行10 min 的離心，將樣品中的脂肪予以去除，然后取5 mL 樣品依次加入150 μL 硫酸鋅（1 mol·L-1）和亞鐵氰化鉀（0.36 mol·L-1），每次加入后均需要進(jìn)行5 min 的漩渦混合振蕩，再次選擇3 500 r·min-1進(jìn)行 10 min 的離心，然后取上層清液使用PBS 依次將其稀釋成為8、4、2、0 倍。

1.3.8 樣品CIP 殘留測(cè)定

分別添加CIP標(biāo)準(zhǔn)品至牛奶樣品中使其濃度依次為 0 ng·mL-1、6.25 ng·mL-1、12.50 ng·mL-1和25.00 ng·mL-1，然后按要求對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)處理后使用試紙條予以檢測(cè)，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定標(biāo)記材料質(zhì)量

本次研究中所制備的膠體金呈酒紅色，透明澄清，表面沒(méi)有任何漂浮物存在，初步判斷本次研究所制備的膠體金質(zhì)量較好，其顆粒大小較為均勻。

2.2 確定最適pH 值

考慮到膠體金會(huì)直接導(dǎo)致pH 計(jì)受到損壞，因此在本研究中主要借助K2CO3溶液的消耗量來(lái)表示相應(yīng)的pH 值，這樣做的好處在于既可以實(shí)現(xiàn)方便表達(dá)，同時(shí)也有利于對(duì)pH 值予以有效調(diào)節(jié)。抗體與膠體金溶液（1 mL）結(jié)合最適的K2CO3消耗量為25 μL。

2.3 確定最適蛋白量

當(dāng)抗體蛋白用量＜9 μg 的時(shí)，伴隨增大抗體蛋白用量，吸光值也會(huì)逐漸增加；而當(dāng)抗體蛋白用 量≥9 μg·mL-1的時(shí)，其吸光度值會(huì)趨于平衡，據(jù)此可以判定抗體蛋白用量為9 μg·mL-1時(shí)，其與膠體金間的結(jié)合最好。

2.4 確定試紙條檢出限

如圖1 所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為6.25 ng·mL-1的時(shí)，檢測(cè)線顏色變化最為明顯，伴隨標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加而逐漸變淺。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為12.5 ng·mL-1的時(shí)， T 線完全消失，因此判定在實(shí)際樣品中膠體金標(biāo)記免疫層析試紙條方法的檢出限應(yīng)當(dāng)是6.25 ng·mL-1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果圖

2.5 樣品CIP 殘留測(cè)定

如圖2 所示，樣品的濃度為12.50 ng·mL-1時(shí)，與對(duì)照品有著最為明顯的差異，當(dāng)樣品的濃度為 25.00 ng·mL-1時(shí)，T 線已經(jīng)完全消失，因此12.50 ng·mL-1即為牛奶樣品的最低檢出限。

圖2 樣品與對(duì)照品測(cè)定結(jié)果圖

3 結(jié)論

伴隨ENR 在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的廣泛應(yīng)用，檢測(cè)ENR的代謝產(chǎn)物CIP 對(duì)于確保食品安全以及保障人們身體健康有著尤為重要的意義。當(dāng)前檢測(cè)CIP 的方法主要有液相質(zhì)譜儀、液相或者其他儀器方法，然而如果采用上述方法來(lái)檢測(cè)CIP 殘留，除了前處理方法較為復(fù)雜之外，所需要的相關(guān)儀器設(shè)備往往也較為昂貴，同時(shí)，上述方法的運(yùn)用還需要較為專業(yè)的技術(shù)人員，僅適合用于少量樣品的檢測(cè)，如果涉及到大量樣品的快速檢測(cè)，上述方法就不再適用。采用GICT 來(lái)檢測(cè)牛奶中CIP 殘留，具有樣品處理程序簡(jiǎn)單、試紙條穩(wěn)定性良好、檢測(cè)成本相對(duì)低廉以及點(diǎn)樣后大概10 min 左右就能夠肉眼快速判定檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，因此值得在現(xiàn)場(chǎng)快速篩查中推廣使用。