凍融循環對大目金槍魚質構與蛋白質特性變化的影響

藍蔚青，孫雨晴，肖 蕾，梅 俊，謝 晶,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

金槍魚是一種極具營養價值的經濟魚類，主要分布在印度洋、太平洋與大西洋中部等熱帶、亞熱帶海域，屬大洋性高洄游性魚[1]。其肉質滑嫩鮮美、低脂肪、高蛋白，被國際營養組織推薦為世界三大營養魚類之一[2]。金槍魚為遠洋運輸魚類之一，為防止魚肉在運輸過程中營養價值降低，其貯藏溫度一般要求在-55～-60 ℃，甚至更低溫度[3]。但實際生產中，金槍魚經捕撈屠宰后在供消費者食用前需經過多次中轉，受到冷鏈技術條件和外界條件限制，并不能嚴格確保產品始終貯藏在此溫度下，溫度變化導致產品反復凍融循環最多可達4～6 次[4]。此外，因金槍魚價格較高，易出現部分一次未售完的魚肉經多次凍藏后被再次銷售的現象，反復凍融處理會導致魚肉組織中冰晶重結晶，蛋白質變性，嚴重影響了金槍魚的食用品質[5-6]。因此，研究凍融循環對金槍魚品質變化影響意義重大。目前，已有部分學者針對反復凍融對水產品品質的影響開展了相關研究工作。其中，鄧思楊等[7]研究得出冷凍-解凍循環會破壞錦鯉魚肌原纖維蛋白的完整結構，降低蛋白質的功能特性；井月欣等[8]分析了凍融循環對大菱鲆不同部位肌肉品質的影響，結果顯示背部肌肉的質量損失小于腹部，凍融循環次數越多，肌肉品質越差；Tan Mingqian等[9]研究了凍融循環對即食海參品質的影響，結果表明多次凍融循環會導致海參的膠原含量下降與顯微結構破壞，理化性質隨之發生改變。

目前關于凍融循環對金槍魚品質變化影響的研究還不多。本實驗以大目金槍魚（Thunnus obesus）為原料，模擬兩種凍融循環方式（超市凍融處理F1與家庭凍融處理F2），通過測定魚肉解凍后的理化指標（汁液流失率、質構特性、高鐵肌紅蛋白相對含量、肌原纖維蛋白含量、總巰基含量與Ca2+-ATPase活力），同時結合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）與核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術共同表征凍融循環過程中凍融循環次數對大目金槍魚組織與蛋白質特性的影響，旨在為大目金槍魚流通銷售過程中冷鏈技術發展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大目金槍魚于2019年6月由遠洋控股集團（中國）有限公司在太平洋近海捕撈后直接屠宰抽真空并凍藏（-55 ℃）。

總巰基含量測定試劑盒、超微量Ca2+-ATPase活力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；十二水合磷酸氫鈉、二水合磷酸氫鈉 國藥集團化學試劑有限公司；氯化鉀、氫氧化鈉、氯化鈉 上海埃彼化學試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉四水合物、SDS、三羥甲基氨基甲烷、反丁烯二酸、甘氨酸（均為分析純） 上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SLFPTAD型多功能酶標儀 上海基因有限公司；DW-86L388型立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；FJ200-S型數顯高速均質機 杭州齊威儀器有限公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BS210S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；722型可見分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司；MesoMR23-060H-1型LF-NMR儀 上海紐邁電子科技有限公司；TA.XT Plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；1658001型小型垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 凍融循環設計

將質量為400～500 g真空包裝的大目金槍魚魚樣分為兩組平鋪于指定溫度下的冰箱內。其中，F1組（超市凍融處理）樣品在-55 ℃冰箱中貯藏24 h后取出，置于2 ℃陳列柜中自然解凍，將溫度采集儀的熱電偶探頭插入魚塊中，解凍至樣品中心溫度-5 ℃為解凍終點，全過程為完成一次凍融，按上述方法共反復凍融5 次；F2組（家庭凍融處理）樣品在-18 ℃冰箱中貯藏24 h后取出，置于4 ℃冰箱中自然解凍，將溫度采集儀的熱電偶探頭插入魚塊中，解凍至樣品中心溫度-5 ℃時為解凍終點，全過程為完成一次凍融，按上述方法共反復凍融5 次。

1.3.2 汁液流失率的測定

參考張丹等[4]的方法對大目金槍魚汁液流失率進行測定。解凍后的魚塊用濾紙吸去表面水分，使用電子天平分別對解凍前后魚塊精確稱質量，魚肉解凍后汁液流失率按公式（1）計算。

1.3.3 質構特性測定

將大目金槍魚背部魚肉切成20 mm×15 mm×10 mm的方塊，樣品按垂直于其厚度的方向平放。參考李念文等[10]的實驗條件進行質構分析：平底柱形探頭P/6（直徑6 mm）；測前速率3 mm/s；測試速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，壓縮變形率50%，探頭2 次測試間隔5.00 s；數據采集速率200 Hz；測試環境溫度12～16 ℃。測定其硬度、黏性、彈性和咀嚼性，每組樣品平行測定6 次，取其平均值。

1.3.4 高鐵肌紅蛋白相對含量的測定

參考Thiansilakul等[11]的方法進行高鐵肌紅蛋白相對含量測定。準確稱取剁碎的魚肉3.0 g加入離心管，量取15 mL磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L）加入離心管，均質，4 ℃、10 000 r/min離心20 min后取上清液，在525、545、565 nm和572 nm波長處測定吸光度，按公式（2）計算高鐵肌紅蛋白相對含量。

1.3.5 肌原纖維蛋白含量的測定

肌原纖維蛋白含量的測定參照劉琴等[12]的方法并稍作改動。稱取剁碎的大目金槍魚肉3.0 g于離心管，按料液比1∶4添加pH 6.6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），均質后，在4 ℃下10 000 r/min離心10 min后棄去上清液，接著向沉淀中加入比例同上的PBS均質后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，均質-離心重復3 次后，用0.7 mol/L NaCl溶液清洗沉淀，離心后所得上清液即為肌原纖維蛋白樣品，根據雙縮脲法對肌原纖維蛋白含量進行測定。

1.3.6 Ca2+-ATPase活力的測定

根據超微量Ca2+-ATPase活力測定試劑盒操作步驟，對提取的肌原纖維蛋白進行酶促反應，混勻后于3 500 r/min離心10 min，取上清液加入顯色劑后混勻定磷。室溫下靜置5 min，在636 nm波長處測定吸光度。按試劑盒說明書計算Ca2+-ATPase活力，Ca2+-ATPase活力用每毫克蛋白中所含酶活力單位表示（U/mg）。

1.3.7 總巰基含量的測定

參照總巰基含量測定試劑盒中操作步驟加入相應試劑，靜置5 min，在405 nm波長處用酶標儀測定其OD值，按試劑盒說明書計算總巰基含量。

1.3.8 SDS-PAGE分析

參照高艷利等[13]的實驗方法進行SDS-PAGE分析。將20 μL肌原纖維蛋白提取液與5 μL Loading buffer混合，100 ℃下水浴15 min，冷卻到室溫后取15 μL混合液進行SDS-PAGE分析。電泳條件：濃縮膠電壓90 V、分離膠電壓180 V。使用考馬斯亮藍將凝膠染色30 min后取出，放入脫色液中脫色，直至蛋白質條帶及背景清晰，用電泳自動成像儀拍攝凝膠后進行分析。

1.3.9 LF-NMR與MRI分析

使用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）序列測定LF-NMR橫向弛豫時間（T2），參照趙宏強[14]的T2測定參數。為防止水分損失，將質量約為10 g的魚肉用保鮮膜包封后放入核磁管中分析，每組樣品平行測定3 次。采用MRI技術分析魚樣的氫質子密度與分布，參照趙宏強[14]的測定條件，最終的魚肉質子密度圖譜由8 次掃描重復累加所得，質子密度圖由上海紐邁科技公司統一進行映射、偽彩處理得到。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS 13.0軟件中的Duncan新復極差法對數據間差異進行方差分析與多重比較，采用Origin 8.5軟件繪制曲線，最終實驗數據均為每組樣品的3 次平行實驗平均值，并以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 凍融循環對大目金槍魚汁液流失率的影響

圖1 凍融循環對大目金槍魚汁液流失率的影響Fig.1 Effect of freeze-thaw cycles on thaw drip loss rate in big-eye tuna

如圖1所示，大目金槍魚在凍融過程中發生了不同程度的汁液流失，其中F1組魚樣凍融循環過程中的汁液流失率更高，表明溫度波動幅度越大，汁液流失越嚴重。第5次凍融循環后F1組魚樣解凍汁液流失率稍有下降，可能是由于魚樣在第5次凍融時，其品質超過最大凍融循環次數極限，開始出現腐敗；F2組魚樣在5 次凍融循環過程中解凍汁液流失率呈緩慢增長趨勢。反復凍融過程中溫度波動引起冰晶重結晶，導致其組織結構被破壞，肌原纖維脫水，引起蛋白質變性，魚樣完全解凍后水分流失現象嚴重。葉伏林等[15]研究了反復凍融對黃鰭金槍魚品質影響，結果表明隨著反復凍融循環次數的增加，汁液流失率升高，其結果與本研究結果相似。

2.2 凍融循環對大目金槍魚質構特性的影響

圖2 凍融循環對大目金槍魚質構特性的影響Fig.2 Effect of freeze-thaw cycles on TPA parameters of big-eye tuna

如圖2所示，隨著凍融循環次數的增加，蛋白質的降解變性相對劇烈，質構劣變則越來越顯著。F1和F2組魚肉凍融過程的硬度（圖2A）、彈性（圖2B）與咀嚼性（圖2C）均呈下降趨勢，黏性（圖2D）呈上升趨勢。到第4次凍融時，F1組樣品的硬度低于F2組，而咀嚼性、黏性略高于F2組。這可能是由于大目金槍魚在反復凍融過程中汁液流失率逐漸上升，蛋白質肌肉組織發生降解，導致其硬度下降[15]。黏性明顯上升，說明其在反復凍結解凍過程中，微生物的作用使其腐敗速率加快，由此產生黏液。已有研究表明，魚類肌肉蛋白中占主導地位的肌原纖維降解是導致其硬度和彈性降低的主因[16]。Tan Mingqian等[9]的研究表明反復凍融對即食海參的質構特性有顯著影響，這與本實驗結果相符。

2.3 凍融循環對大目金槍魚高鐵肌紅蛋白相對含量的影響

圖3 凍融循環對大目金槍魚高鐵肌紅蛋白相對含量的影響Fig.3 Effect of freeze-thaw cycles on metmyoglobin relative content in big-eye tuna

新鮮大目金槍魚肉所呈鮮紅色主要是氧合肌紅蛋白作用的結果。魚肉在凍藏過程中含Fe2+的氧合肌紅蛋白與還原型肌紅蛋白進一步被氧化成含Fe3+的高鐵肌紅蛋白，導致魚肉呈褐色；高鐵肌紅蛋白相對含量越高，魚肉褐變越嚴重，降低凍藏溫度可有效減緩魚肉中的氧合肌紅蛋白氧化為高鐵肌紅蛋白的速率[15]。如圖3所示，F1和F2組魚肉隨凍融循環次數的增加，高鐵肌紅蛋白相對含量呈整體上升趨勢，這是由于魚肉中的還原型肌紅蛋白與氧合肌紅蛋白發生自動氧化，生成呈褐色含Fe3+的高鐵肌紅蛋白[17]。在反復凍融過程中，F2組魚肉的高鐵肌紅蛋白相對含量上升速率較快，說明與凍藏溫度-55 ℃相比，凍藏溫度-18 ℃下反復凍融更易生成高鐵肌紅蛋白。楊金生等[18]研究了不同凍藏溫度對金槍魚高鐵肌紅蛋白相對含量的影響時發現，高鐵肌紅蛋白相對含量隨著凍藏時間的延長逐漸上升，凍藏溫度越高，高鐵肌紅蛋白相對含量的上升速率越快，其研究結果與本實驗結果相一致。

2.4 凍融循環對大目金槍魚肌原纖維蛋白含量的影響

肌原纖維蛋白是魚類肌肉中最主要的蛋白質，約占總蛋白含量的50%～55%，具有重要生物學功能[19]。其形態特征是魚肉的組織學基礎，在某種程度上決定了魚肉品質，因此通常可用肌原纖維含量及結構變化評價魚肉品質[20]。Li Fangfei等[21]研究發現，凍融循環過程中的蛋白質變性聚集是導致肌肉蛋白質溶解性顯著降低的重要原因。

圖4 凍融循環對大目金槍魚肌原纖維蛋白含量的影響Fig.4 Effect of freeze-thaw cycle on myofibrillar protein content in big-eye tuna

如圖4所示，隨著凍融循環次數的增加，大目金槍魚的肌原纖維蛋白含量下降。其中，F1組樣品的肌原纖維蛋白含量降幅不明顯，而F2組樣品的肌原纖維蛋白含量隨著凍融循環次數的增加逐漸降低，第5次凍融時已從凍融1 次時的28.11 mg/g降至10.37 mg/g。說明相較于凍藏溫度-55 ℃下的反復凍融，凍藏溫度-18 ℃下的反復凍融魚肉中肌原纖維蛋白含量下降程度更顯著。肌原纖維蛋白屬鹽溶性蛋白，凍藏溫度高于共晶點時，蛋白質變性程度隨溫度升高而加劇，同時鹽溶性蛋白含量下降速率變快。Benjakul等[22]的研究證明，反復凍融會對鱈魚中蛋白質含量產生明顯影響，鹽溶性蛋白含量隨凍融循環次數的增加呈下降趨勢，經過5 次反復凍融后鹽溶性蛋白含量明顯下降。

2.5 凍融循環對大目金槍魚總巰基含量的影響

肌原纖維蛋白總巰基包含活性巰基和隱藏巰基兩部分，其含量可反映魚肉蛋白質變性聚合程度[23]。肌球蛋白的總巰基含量可作為判斷蛋白質變性程度的重要指標，反映蛋白質空間構象變化[24]。凍融循環與溫度波動對大目金槍魚總巰基含量的影響如圖5所示。

圖5 凍融循環對大目金槍魚總巰基含量的影響Fig.5 Effect of freeze-thaw cycles on total sulfhydryl content in big-eye tuna

如圖5所示，隨著凍融循環次數增加，各組樣品的總巰基含量均顯著下降，F2組樣品經5 次反復凍融后，與凍融1 次相比降幅達91.73%。表明樣品在凍融過程中由于蛋白質發生降解，蛋白質內部的活性巰基暴露，被氧化為二硫鍵，總巰基含量降低。Zhang Longteng等[25]通過實驗證實了反復凍融會導致鳙魚魚肉中的總巰基含量下降，與本實驗結果相符。

2.6 凍融循環對大目金槍魚Ca2+-ATPase活力的影響

肌原纖維蛋白具有Ca2+-ATPase活力，魚肉在凍藏過程中，蛋白質變性會引起Ca2+-ATPase活力的變化，因此該酶活力被廣泛用于評價魚肉蛋白質變性程度[26]。

圖6 凍融循環對大目金槍魚Ca2+-ATPase活力的影響Fig.6 Effect of freeze-thaw cycles on Ca2+-ATPase activity in big-eye tuna

如圖6所示，隨著反復凍融循環次數的增加，兩組樣品的Ca2+-ATPase活力均呈下降趨勢，其中F2組下降更明顯，可見樣品中的Ca2+-ATPase活力與凍融循環次數、凍藏溫度密切相關。有研究表明Ca2+-ATPase活力降低與肌漿球蛋白頭部構象變化及該部分蛋白聚集或相互作用引起的重排、巰基氧化形成二硫鍵導致分子發生聚合等因素密切相關[27]。不同溫度下導致肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力下降的因素不同，較高溫度下Ca2+-ATPase活力降低是由巰基氧化和pH值下降引起；較低溫度下，pH值下降緩慢，Ca2+-ATPase活力降低則主要由巰基氧化引起[28]。曾名勇等[28]研究發現在不同凍藏溫度下，魚肌肉蛋白的Ca2+-ATPase活力均呈下降趨勢，且凍藏溫度的降低有利于減緩Ca2+-ATPase活力的下降。

2.7 凍融循環對大目金槍魚總蛋白降解作用的影響

圖7 凍融循環對大目金槍魚總蛋白降解作用的影響Fig.7 Effect of freeze-thaw cycles on total protein degradation in big-eye tuna

由圖7可以看出，肌原纖維蛋白主要有4 個條帶，這些條帶由上至下依次是肌球蛋白重鏈（220 kDa）、副肌球蛋白（100 kDa）、肌動蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（36 kDa）。

如圖7所示，大目金槍魚肉經反復凍融后，蛋白條帶隨凍融循環次數的增加而逐漸變窄變淡，5 次凍融循環后220、100、43 kDa和36 kDa處蛋白條帶已基本消失。其中，F2組的變化最明顯，其在第1次凍融后蛋白條帶灰度已明顯減弱，而F1組樣品的變化較緩，其在第3次凍融時條帶仍保持較明顯的灰度。結果表明反復凍融會使肌肉蛋白發生部分降解，凍融循環次數越多，則蛋白質降解越明顯，同時巰基基團間相互作用導致更多二硫鍵生成，蛋白質溶解度下降，發生變性聚集；凍藏、解凍溫度越高，其降解速度也越快。Lan Weiqing等[29]研究了反復凍融對南美白對蝦蛋白質變化影響，結果與本實驗相符。大目金槍魚在凍融過程中的肌原纖維蛋白含量、總巰基含量、Ca2+-ATPase活力與SDS-PAGE分析結果均能反映其蛋白質功能特性顯著劣變，由此判斷隨著凍融循環次數的增加，樣品的蛋白質功能特性發生顯著變化，在第4次凍融時已發生腐敗。

2.8 大目金槍魚水分LF-NMR與MRI分析結果

LF-NMR技術一般將氫核（1H）作為研究對象。弛豫是通過非輻射的方式，使氫核從高能態向低能態轉變的過程。與縱向弛豫時間（自旋-晶格弛豫時間）T1相比，橫向弛豫時間（自旋-自旋弛豫時間）T2能更準確區分樣品中不同狀態的水分，因此食品中弛豫時間多用氫質子的橫向弛豫時間T2表示。T2越小，表示水與其他分子結合越緊密；反之水分越自由。根據T2弛豫譜中曲線的波峰位置可判斷出樣品中水的存在狀態，大分子結構中存在的水波峰區域為T2b（＜1 ms），與大分子緊密結合水波峰區域為T21（1～10 ms），不可移動水波峰區域為T22（30～100 ms），可自由流動水波峰區域為T23（＞100 ms）[30]。

圖8 凍融循環對大目金槍魚橫向弛豫時間變化的影響Fig.8 Effect of freeze-thaw cycles on water proton relaxation time in big-eye tuna

如圖8所示，兩組樣品在凍融期間均呈現出T22峰的相對面積逐漸降低、T23峰相對面積相應升高的趨勢；結合水相對含量基本保持不變，說明不可移動水隨凍融循環次數的增加轉變為自由水流出。其中，F1組樣品隨凍融循環次數增加自由水相對含量始終呈增加趨勢，因為溫度越低，汁液流失也越嚴重，F2組樣品在凍融初期時不可移動水相對含量較高，到第4次凍融時則開始下降，兩組凍融過程T2變化與汁液流失及蛋白質變性結果相符。由此可知，反復凍融會促進蛋白質的去折疊與變性，減弱蛋白質分子作用力，魚肉組織結構發生物理變化導致肌節與肌纖維分離、肌纖維間縫隙增加、肌纖維保水性下降，處于魚肉肌原纖維內的水分散失。Li Fangfei等[21]研究表明反復凍融過程中冰晶的重新分布與蛋白質變性造成的機械損傷是水分轉移和流失的根本原因。

核磁成像偽彩圖中的紅色表示1H質子密度高，該部分魚肉的水分含量高，藍色表示水分含量低，因此由信號顏色變化可反映其水分含量與遷移特點[31]。

圖9 凍融循環對大目金槍魚MRI圖像變化的影響Fig.9 Effect of freeze-thaw cycles on MRI image of big-eye tuna

由圖9可知，氫質子密度圖與魚肉的橫向弛豫時間T2結果相符，隨著凍融循環次數的增加，偽彩圖中魚肉的亮度逐漸下降。其中，F1組魚樣經過5 次反復凍融后，呈現較多藍色，可見其解凍后汁液流失明顯；F2組魚樣的含水量變化不明顯。由此表明反復凍融過程中，F1組魚肉的蛋白質結構已發生改變，存在于肌原纖維內的不可移動水隨著凍融循環次數的增加而轉變為自由水流失。蛋白質在凍藏過程中疏水性的增加可歸因于蛋白質的展開、疏水性脂肪酸與芳香族氨基酸的暴露。李俠等[32]通過MRI表征了不同凍藏溫度下牛肉解凍后的汁液流失率，其結果與本實驗結論相符。

3 結 論

反復凍融會引起大目金槍魚肌肉質構特性變化，破壞其蛋白結構，影響食用品質。隨著凍融循環次數的增加，解凍汁液流失率升高，魚肉硬度、彈性與咀嚼性顯著下降；肌原纖維蛋白含量、總巰基含量與Ca2+-ATPase活力下降，高鐵肌紅蛋白相對含量升高。反復凍融會使肌肉蛋白部分降解，凍融循環次數越多，蛋白質降解程度越明顯，凍藏溫度越高，其降解速度越快。其中，與F2相比，F1凍融處理雖能抑制魚樣中蛋白質的降解變性，但會導致汁液流失率升高，質構特性變差。因此，金槍魚在運輸、貯藏與消費過程中應健全冷鏈技術，盡量避免因溫度波動引起肌肉的反復凍融，溫度波動不宜劇烈，以減少其品質劣變。