運輸應激對魚類生理特性和肌肉品質影響的研究進展

尤孝鵬，汪 蘭,2，熊光權，喬 宇，吳文錦，李 新，丁安子，孫衛青,

（1.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

運輸作為魚類生產過程中不可避免的一環，其通常會導致魚類的生存環境突然改變，進而引發魚體的應激反應。與正常狀態相比，魚類在發生應激反應時，體內激素的分泌和物質能量代謝等生理生化過程會發生顯著變化，這會直接影響魚體的健康甚至威脅生命，并對其肌肉的品質造成不利影響。目前，大部分有關魚類應激的研究是以生理特性為主，對肌肉品質的研究較少，而對其機制的研究則更少。本文為從源頭上緩解魚類運輸應激并最大程度保證魚體健康和最佳肉品質提供更可靠的理論參考。

1 魚類運輸和應激

1.1 應激

應激是指機體受到脅迫時所表現出的緊張狀態，是機體對抗對自身內環境穩態有威脅的各種刺激的過程，也是一種使機體保持生物學合理狀態的自我防御方式[1]。此概念根據觀察到的動物在應對如溫度脅迫時所發生的非特異性反應提出，這種狀態被稱為“全身適應綜合癥”，后又稱“應激”[2]。

應激反應通常是由神經、內分泌、免疫系統協調完成的生理活動，可分為4 個層次：惡性應激、良性應激、強應激、弱應激[3]。生物應激反應具有主動性和復雜性的特點，具體表現為4 個方面[4]：1）生物體具有主動修復損傷的機制；2）生物體所具備的適應性增強了對重復或某持續刺激的抵抗性；3）一種應激反應可能會引發機體其他系統的應激；4）應激反應在行為上的特征是減少或避免與應激源的直接接觸。根據Selye[5-6]和Tachè[7]等的研究將應激反應過程分為3 個階段：警覺階段、抵抗階段、衰竭階段。

1.2 引起魚類運輸應激的因素

魚類的運輸應激是指在魚類運輸過程中，禁食、生存環境突然改變或碰撞等因素綜合影響下產生的適應性或防御性反應[8]。主要的誘發因素包括氨氮脅迫、擁擠脅迫、溫度脅迫、振動脅迫。

1.2.1 氨氮脅迫

運輸過程中水體的氨氮主要來源于魚類的排泄物，氨氮水平是影響運輸成活率的重要因素。例如高濃度的氨氮會傷害魚的鰓絲表皮細胞，引起氣體交換功能障礙，并會破壞滲透平衡性，從而導致部分組織病變，降低機體免疫力甚至威脅生命[9]。吳利敏等[10]研究發現急性氨氮脅迫會對淇河鯽幼魚腦、鰓、肝等組織結構產生較大損傷。

1.2.2 擁擠脅迫

魚類的生長和運輸需要合理的密度，密度過大會造成擁擠脅迫而降低存活率及魚類福利[11]，Mechesso等[12]在對比目魚的研究中發現擁擠脅迫會使其血漿皮質醇含量顯著上升，熊梅等[13]在對草魚的研究中也得出了相同的結論，并發現擁擠脅迫導致草魚肌肉硬度和凝聚性顯著下降。

1.2.3 溫度脅迫

不同魚類有不同的適宜生長溫度范圍，例如冷水魚在運輸過程中會由于水溫的升高而引起熱應激，王曉雯等[14]研究表明急性運輸熱應激會對西伯利亞鱘幼魚的肝臟功能產生不利影響，并通過肝臟中熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70和HSP90的mRNA大量表達以調節生理平衡，減少熱應激對機體的損傷[15]，韓邦等[16]在對波紋唇魚免疫功能的研究中發現熱應激會導致其免疫功能顯著減弱。

1.2.4 振動脅迫

運輸過程中因各種不可控因素而造成的顛簸和水體振動會引發魚類的應激反應。王文博[17]對鯽魚的振動脅迫進行了研究，發現受到振動脅迫后的鯽魚血清皮質醇水平顯著高于正常組，Demers等[18]在虹鱒魚的振動脅迫研究中也得到了相同的結論。

1.3 運輸應激對魚類生理特性的影響

魚類運輸應激屬于急性應激，會迫使機體的理化狀態改變，破壞內環境穩態并為此付出“生物學代價”[19]，造成魚類免疫力下降，同時機體由于過氧化導致抗氧化酶活力降低，具有抗氧化性的非酶類物質如谷胱甘肽被過度消耗，機體無法及時有效地清除氧自由基，最終造成機體的氧化損傷。上述現象的根本原因是應激狀態下魚體將重置機體內物質能量的分配與利用，致使原來的神經、內分泌、免疫等系統功能發生變化，而這些變化可以由某些特定物質來表征。

魚類發生應激反應時，下丘腦-垂體-腎間組織（hypothalamic-pituitary-interrenal，HPI）軸的激活和作用是最主要的神經-體液-免疫調節機制[20]。例如HPI軸通過釋放皮質類固醇激素提高能量代謝水平，同時血糖和血漿皮質醇濃度升高以應對應激[21]。血液中的血漿作為動物的細胞外液，各組分含量的變化往往能準確顯示機體的生理狀態。魚類血液中與應激有關的組分如兒茶酚胺（包括腎上腺素和去甲腎上腺素）、皮質醇以及血糖等濃度的變化能實時有效地反映應激反應的狀態[22]。皮質醇作為典型的糖皮質激素，其含量在應激反應初期顯著升高，因此被廣泛應用于魚類應激狀況的評估[23]。兒茶酚胺的代謝速率較快，不易量化，故應用較少。血糖濃度是應激反應中反映能量代謝變化的主要指標之一，由于糖原分解和糖異生作用加劇，通常導致應激反應過程中血糖濃度升高，反映了應激反應的持續性[24]。

作為分子伴侶的HSPs是參與機體應激反應的細胞內合成的一類蛋白質，可以催化變性蛋白的重新折疊并調節許多信號傳導途徑，起到修復細胞損傷和應激保護的作用[25]。作為一種廣泛存在于真核、原核細胞中且進化上高度保守的蛋白質，其含量的變化可較準確地反映應激反應的進展[26]。HSPs表達量的升高是魚類應激過程中的典型特征[27-28]，如虹鱒魚在運動疲勞應激時肌肉和心臟中HSP水平顯著升高[29]。

綜上，通過監測魚類血液或其他組織器官中的某些特定物質含量的變化，可以判斷魚類是否發生應激反應以及該反應的劇烈程度。除上述例舉出的較傳統且典型的血漿或內臟組織中的物質外，很多學者還發現了可用于研究魚類應激的其他特征物，如Bulloch等[30]研究發現魚黏液中的F2-異前列腺素可作為表征魚體內氧化應激的生物標志物。

1.4 運輸應激對魚類肌肉品質的影響

運輸應激反應對能量的需求量大，處于急性應激狀態下的魚體內糖代謝相關酶活性顯著增強，同時肌肉內糖原含量顯著降低，血糖濃度升高[31-32]。這表明應激提高了魚體生命活動，可能引起機體無氧糖酵解、脂質過氧化等反應加劇。這時機體會動員能量代謝相關的理化反應以適應應激，這個過程會積累大量代謝產物，導致肌肉品質劣化[33-34]。pH值是評價肌肉品質的重要指標之一，引起魚類肌肉pH值降低的原因有很多，如應激過程中乳酸的大量堆積[35]。研究表明運輸應激會使魚類肌肉pH值降低，導致肌肉品質劣化[36]。pH值降低會影響肌肉品質，如其能夠引起肌肉剪切力下降，使肉質松散[37]，還可能使肌肉的質構特性變差[38]，降低肌肉硬度[39]。簡而言之，魚類肌肉品質隨pH值的降低而降低[40]。運輸應激還會導致魚類肌肉持水能力下降而形成PSE（pale soft exudative）肉，研究發現運輸應激后的大西洋鱈肌肉含水量顯著降低[41]，這可能是魚體代謝紊亂以及參與代謝的酶功能異常引起的。運輸應激對魚類肌肉色澤也有一定影響，張玉平等[42]發現異育銀鯽在4 h的模擬運輸后，肌肉的L*、a*、b*值均降低，體色變暗。此外，魚類的應激反應還可能造成肌纖維損傷（線粒體膜破損、排列松散、肌節腫脹甚至降解等），以及由于應激過程中物質能量代謝失調而導致肌肉中營養物質的大量損失等不利影響。魚類的應激反應甚至會通過減少蛋白質合成而導致肌肉萎縮[43]。

1.5 減緩魚類應激的方法

目前減緩魚類應激的方法主要包括良種培育、藥物緩解、優化養殖環境、規范化操作等[44]。首先，基于不同品種或個體間發生應激反應的強度以及對應激的耐受力存在差異，且這種差異具有遺傳性的事實[45]，可結合細胞和基因工程等技術通過品系間雜交育種定向選育耐應激的新品系，例如研究人員已對黃鰭鯛和鱸魚進行了耐鹽度選擇實驗[46]；其次，藥物緩解魚類應激是目前養殖生產中應用最廣的措施，包括免疫增強劑、麻醉劑和鎮靜類藥物；再者，養殖環境是決定魚類健康的重要條件，保證良好的水質、合適的背景顏色、水體流速、溫度和光照，以及科學的養殖密度和污染物排放尤為關鍵[47]，良好的養殖環境會提高魚體的耐受力，減緩運輸應激；最后，生產實踐中需規范化操作，包括制定合理的生產計劃、選擇最佳養殖模式和工具、科學喂料、定期消毒、適時捕撈等[48]。在進行活魚運輸時，應根據品種和路況的不同，選擇最佳運輸方式，控制合理的運輸密度和水溫，必要時可輔以純氧運輸。

2 應激對魚類生理代謝的影響

2.1 應激對魚類代謝途徑的影響

魚類的應激是由一系列內在生理調控和外在行為組成的綜合反應，除肉眼可見的外在行為外，復雜的生理調控主要包括神經內分泌激素調節、物質能量代謝調節、信號傳導、蛋白質修飾以及基因表達調控等，是魚類在應激狀態下產生各種反常行為的根本原因，同時這些理化過程互相交聯、共同作用，可構成多個獨立而又互相關聯的代謝途徑（通路）。代謝途徑的調控是應激反應研究領域的重點，一條代謝途徑代表一個完整的反應體系，是在多酶體系的催化下完成的一個或多個酶促化學反應[49]。應激反應對代謝途徑的影響通常表現為后者被激活或被抑制，反過來，某些物質的代謝會直接影響或決定魚類對某些應激因子的耐受性，通過這些特定物質的含量、活性、存在狀態或空間結構等往往可以準確評估魚類的代謝狀態，因此，這些物質可作為魚類應激反應中的生物標志物。

目前，很多學者已發現并驗證了部分與應激反應有關的代謝途徑。糖原是機體內重要的功能物質，且正常情況下肝糖原比肌糖原更穩定，郭志雄等[50]研究發現急性低氧應激激活了大規格軍曹魚幼魚肝臟的糖酵解途徑，表現為肝糖原濃度較正常幼魚低，同時乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶和己糖激酶的活力均極顯著升高，這表明機體主動激活了無氧代謝相關途徑以對抗由于低氧脅迫下機體有氧代謝被抑制而導致的能量供給不足，這可能是機體的一種自我補償機制。溫度是影響魚類新陳代謝的關鍵因素，且不同組織對此有不同的反應，Sun Junlong等[51]對鯉魚的熱脅迫進行了研究，發現鯉魚的呼吸頻率與水溫呈正相關，且熱應激狀態下的鯉魚肌肉中脂蛋白脂肪酶和肝脂肪酶的活力最低，導致甘油三酯水平顯著升高，而在肝臟中的變化則恰好相反，這表明鯉魚的肌肉和肝臟中的脂質代謝途徑在發生熱應激時可能有不同的對抗機制，魚類通常會在冬季受低溫的影響而減少其活動，若此時水溫突然上升則可能引發魚類的急性熱應激。Richard等[52]在緩解金頭鯛魚冬季的熱應激途徑的研究中，通過對比肝臟的蛋白質組指紋圖譜發現，急性熱應激引發了肝臟的氧化應激和內質網應激，蛋氨酸循環和苯丙氨酸/酪氨酸分解代謝途徑被抑制而導致代謝通量降低，同時抑制了需氧代謝途徑，并降低了糖原異生的能力，最終威脅到魚類的健康。Guillen等[53]在對南極魚的急性熱應激研究中發現，隨著水溫的升高，腎臟中的蘋果酸脫氫酶、葡萄糖6磷酸酶和糖原磷酸化酶的活力增加，同時肝臟中乳酸濃度升高以及腦中的糖原磷酸化酶活力增加，這些特定組織內相關指標的變化表明，在熱應激狀態下的南極魚可能是通過激活體內糖酵解、糖異生等途徑使機體內的糖原分解作用加強以滿足較高的能量需求。Liu Yang等[54]通過將代謝組學和轉錄組學相結合，分析了細鱗鮭發生熱應激時血漿和肝臟代謝的整體變化，結果表明熱應激對細鱗鮭造成了長期影響，能夠抑制其能量代謝，同時改變其脂質、氨基酸、膽堿和核苷酸的代謝，且顯著激活了谷氨酸的代謝，由此認為谷氨酸可能是與熱應激相關的重要生物標志物。這些研究都說明應激因子引發了魚類的適應性或抵御反應，機體內與物質能量代謝、免疫、抗氧化等相關的通路被激活或被抑制，并伴隨相關酶和調控因子的活性以及其對應基因的表達量上調或下調，每個理化過程都互相制約、密切相關，而且在同一應激反應中機體的不同組織器官對同一代謝通路的調控可能存在差異。

2.2 應激影響魚類肌肉品質的途徑

肌肉是所有動物的重要組成部分，是動物產品的主要來源，是最大的能量和氨基酸庫[55]。動物肌肉品質往往受到很多因素的影響，除養殖過程、養殖環境、食物來源和養殖方式外，由于動物受各種不利環境因子、運輸以及屠宰過程的影響而產生的應激反應也會導致其肌肉品質降低、生長緩慢、免疫力降低等情況[56]。目前在應激對動物肌肉品質的影響機理研究中，研究對象較集中于豬、牛、羊、雞等家禽或其他陸生動物，而鮮有對魚類研究的相關報道，作為生理學和食品科學研究的交叉，應激對魚類肌肉品質的影響機理在未來或成熱門研究方向。

基因效應是影響肌肉生長發育和品質的根本因素或自身因素[57]。上述已提到應激會影響相關基因的表達，例如魚類生肌調節因子（myogenetic regulatory factors，MRFs）主要調控動物肌原細胞的分化、肌肉組織的形成，以及生長發育后期肌纖維體積的增大。反過來，在魚體孵化及后期生長階段，各種環境因子會對MRFs及相關調控因子的表達產生影響，這在對虹鱒[58]、尼羅羅非魚[59]和草魚[60]等品種的研究中已經得到初步驗證。因此，基因與環境的共同作用決定了魚類包括肌肉品質在內的各種性狀。

魚體的健康狀態會直接影響應激水平，例如Xie Shiwei等[61]研究發現日糧中的氧化魚油可通過降低大嘴鱸魚肝臟中磷脂和脂肪酸的不飽和度引起魚體的氧化應激，威脅魚的健康。Wan Xuebin等[62]利用轉錄組學技術揭示了皮質醇劣化豬肉品質的機制通路（圖1），當發生應激后，通過轉錄組測序篩選出了大量與鈣通道和細胞凋亡有關的差異表達基因，如Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）、白介素1受體輔助蛋白（interleukin 1 receptor accessory protein，IL-1RAP）、轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGFβ1）、趨化因子2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、分泌磷蛋白1、谷胱甘肽過氧化物酶2（glutathione peroxidase 2，GPX2）、CD3抗原（CD3 antigen,epsilon polypeptide，CD3ε）、趨化因子受體5（C-C motif chemokine receptor 5，CCR5）、轉錄激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）和斯鈣素1（stanniocalcin 1，STC1）等，同時由下丘腦-垂體-腎上腺（the hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸分泌的糖皮質激素（adreno-cortical hormones，GC）濃度上升，GC通過影響TLR3和IL-1RAP誘導骨骼肌細胞凋亡，從而導致核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）（為TLR3和IL-1RAP下游的轉錄因子）活化，此外，NF-κB還作用于半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2（B cell leukemia/lymphoma 2，Bcl-2）和凋亡調節因子（Bcl-2 associated X，BAX）誘導細胞凋亡，從而導致肌肉的正常理化特性發生變化，最終導致肌肉品質下降。Fontagné-Dicharry等[63]在膳食氧化魚油對虹鱒魚氧化應激和抗氧化防御系統影響的研究中也得到了類似的結論，認為氧化魚油對虹鱒魚的生長性能和肝臟抗氧化酶活性沒有影響，原因可能是NF-κB活性的降低。類似地，魚類攝取不同組分和配比的飼料，也會對肌肉產生不同的影響，選擇最佳的飼料配方往往能得到更高的經濟效益[64]。例如飼喂400 g/kg蛋白水平飼料的草魚具有最佳生長性能和肥滿度，而長期投喂高脂肪高蛋白飼料所引起的代謝應激會導致機體脂代謝紊亂，造成脂肪變性[65]。此外，選擇合適的飼料添加劑能提高動物的肌肉品質，Wei Yuting等[66]研究發現在日糧中添加南極磷蝦粉顯著改善了三倍體虹鱒魚的生長性能和肌肉色素沉著，但其改善機制和內在原因還有待深究；Wang Tongxin等[67]研究發現大蒜素通過抑制肌肉糖酵解途徑和增強抗氧化能力，顯著提高了機體免疫力，增強機體對生長環境中應激因子的耐受性并提高肌肉品質。

圖1 飼料中添加的皮質醇劣化豬肉品質的分子機制[62]Fig.1 Molecular mechanism of the effect of dietary cortisol on meat quality deterioration[62]

動物屠宰前的稱質量、運輸、禁食以及屠宰過程中不合理的處理方式等所引起的急性應激，會使動物產生恐懼、受到更多的痛苦，對宰后肌肉品質有較大影響，也是造成PSE肉的主要原因[68-69]。例如腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK）是應激研究中關注度較高的一個調控途徑，也是影響肌肉纖維類型轉化的主要信號轉導途徑，可調節細胞內的能量水平，當ATP被過度消耗或AMP∶ATP比值升高會激活其活性[70]。動物應激發生時，AMPK通過感知細胞能量代謝狀態的變化，并通過影響多個物質代謝的環節以維持能量供求平衡[71]（圖2[72]），機體AMP∶ATP比值升高即能量水平降低時，機體通過肝臟激酶1和鈣調素依賴蛋白激酶作用于AMPKα亞基Thr172以提高AMPK活性，從而抑制能量消耗并刺激能量的生成以改善機體的能量平衡狀態。張銘灝[73]在對AMPK途徑對肌肉品質影響的研究中也得到了類似的結論，其實驗結果顯示宰前急性熱應激顯著降低了宰后肌肉的品質和抗氧化性，AMPK活性的蛋白免疫驗證結果顯示p-AMPK過表達，即AMPK磷酸化水平升高，表明其活性在急性熱應激過程中確實被激活（圖3）。在魚類的研究中也有對AMPK途徑的相關報道，如Wang Congcong等[74]研究發現膳食二十二碳六烯酸通過激活AMPK途徑而促進鈍嘴鯛的白肌增生和肌纖維發育進而改善肌肉的質地和顏色。

魚類的肌肉品質受多種自身和環境因素的調控，應激反應是其中較為常見且覆蓋面較廣的一類影響因子。魚類在應激因子的刺激下產生應激反應時，機體的適應性反應主要是調控各組織器官內某些相關物質的代謝以改變機體所處的生理狀態，使魚體處于疲勞的亞健康狀態，最終劣化魚類的肌肉品質。

圖2 AMPK的結構及能量代謝調控通路[72]Fig.2 Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase structure and energy metabolism control pathway[72]

圖3 宰前不同程度急性熱應激對宰后AMPK活性的影響[73]Fig.3 Effects of different levels of acute heat stress before slaughter on adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase activity in postmortem muscle[73]

2.3 轉錄組學在魚類應激研究中的應用

轉錄組學的概念是由Velculescu等[75]在對酵母基因表達的研究中首次提出。遺傳中心法則顯示遺傳信息以mRNA為“橋梁”從DNA傳遞到蛋白質，其中全部表達的基因及其轉錄水平的綜合被稱為轉錄組。不同于相對穩定、分析成本較高、針對性不強的基因組，轉錄組檢測結果會隨生物發育階段、生存環境和生理狀態等的變化而不同。作為一種功能基因組學研究方法，轉錄組學主要依賴于微矩陣技術，通過收集并分析不同樣本中全部基因的表達調控，同時結合每個基因與美國國家生物技術信息中心中各數據庫比對產生的功能注釋信息綜合分析來解決生物學問題，揭示生物現象的本質[76]。同時，轉錄組本身也是一種遺傳信息，其中的顯著差異表達基因可作為遺傳標記[77]。對于環境脅迫，轉錄組數據可以更準確直接地反映生物的生理變化，因此轉錄組學在目前的魚類應激研究中被廣泛應用[78]。

魚類在應激狀態下的基因表達會發生顯著變化以滿足物質代謝變化的需求，主要表現為各基因表達水平的變化，將這時的差異表達基因進行功能富集、代謝調控途徑富集分析，這對深入了解魚類的應激反應以及緩解措施的研發具有重要意義[79]。以水產養殖過程中魚類常發生急性熱應激為例，Shi Kunpeng等[80]在對大西洋鮭急性熱應激的研究中對其肝臟進行了轉錄組分析，結果顯示大西洋鮭在不同程度急性熱應激反應中有22 個共同的差異表達基因，且大多數是分子伴侶，在此過程中，轉錄激活因子6、鈣網蛋白、蛋白二硫異構酶A3、蛋白激酶R樣內質網激酶-真核起始因子2-α等基因被上調，這些基因的表達產物幾乎都參與內質網應激途徑，其他上調基因大多參與調控胰島素和核苷酸寡聚化域樣受體信號通路以消除錯誤折疊的蛋白質并維持糖和脂質平衡。在這項研究中，轉錄組學結果揭示了大西洋鮭在急性熱應激過程中顯著變化的生理調控過程以及與之相關的功能基因表達水平的變化等分子機制，這對該物種急性熱應激的后續研究以及緩解途徑的研發提供了一定的分子基礎。

目前，應用于魚類應激反應的轉錄組學研究大多以魚類疾病與免疫為主，例如Mu Yinnan等[81]通過轉錄組學研究發現低氧環境脅迫下的大黃魚脾臟和頭腎組織中的差異表達基因大部分與免疫反應相關，且參與調控多種與免疫相關的代謝途徑，激活了厭氧ATP生成途徑，并抑制了能量的過度消耗等。

3 結 語

動物的應激反應較常見且多式多樣，并會顯著影響動物肌肉的理化性質，在水產品的銷售、運輸過程中不可避免會發生，而運輸過程中的急性應激反應是影響魚類健康、決定運輸成活率的主要因素，并最終影響魚類肌肉品質。目前雖然學者們已對魚類應激反應的各方面做了大量研究，揭示了由應激引起的一些理化指標變化的機制，并且闡明了一些物質對應激反應的調控機制，但是都比較有限，不能很好地聯系成一個系統的應激生理調控網絡，且少有應激對肌肉品質影響及調控途徑相關的研究。未來應加強對魚類應激和調控機理的研究，并與肌肉品質的變化相結合，挖掘多種調控途徑間的內在關聯，形成一個完整的應激調控模型，這將有利于尋找或開發出更具針對性的應激緩解物，以保證運輸過程中魚體的健康和獲得優質的產品。