假絲酵母的添加對高鹽稀態(tài)醬油有機(jī)酸含量影響

韓冉，張玲玲，黃文燁，龔佳欣，侯麗華

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

醬油起源于2500多年前的中國，是中國、日本和韓國等東亞國家最廣泛接受的調(diào)味品[1]。由于其獨(dú)特的口感和香氣，它在世界西部地區(qū)的知名度正在急劇增長[2]。目前，我國醬油年產(chǎn)量約600萬噸，占世界總產(chǎn)量的65%以上。我國醬油按其制備工藝的不同，分為高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油(HLFSS)和低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油(LSFSS)。HLFSS的發(fā)酵工藝是在15～30 ℃下，經(jīng)過陳化期(90～180 d)和較高的鹽水溶液濃度(17%～20%)，而LSFSS的生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本低，通常采用相對高溫(40～55 ℃)的純培養(yǎng)物，經(jīng)過老化期(15～30 d)和較低的鹽水溶液濃度(13%～15%)。因此，雖然LSFSS主導(dǎo)了中國醬油市場，但其風(fēng)味品質(zhì)普遍低于傳統(tǒng)HLFSS，HLFSS在中國市場的份額一直在增加。

Sun等[3]采用HS-SPME研究了12個HLFSS樣品中的揮發(fā)物，發(fā)現(xiàn)主要揮發(fā)物質(zhì)是酸類和醇類，并且主要揮發(fā)性基團(tuán)也屬于酸類和醇類，分別占總含量的47%和14%[4]，這些研究結(jié)果表明HLFSS中酸類物質(zhì)的含量與其風(fēng)味息息相關(guān)。

HLFSS在發(fā)酵過程中可以通過添加耐鹽酵母菌如假絲酵母(Candidaetchellsii)來增強(qiáng)醬油的風(fēng)味品質(zhì)。假絲酵母在釀造過程中，利用釀造原料，無需添加其他材料，就能夠進(jìn)行很好的發(fā)酵，主要作用是增酯增香，包括酸類、醇類、酯類、醛類和酚類等，其中酸類物質(zhì)含量最高[5]。目前對于不同時間添加假絲酵母于HLFSS中有機(jī)酸含量的研究以及有機(jī)酸與醬油品質(zhì)關(guān)系的研究相對較少。本文通過測定酸度和酸類物質(zhì)，研究假絲酵母對HLFSS品質(zhì)的影響，為醬油企業(yè)添加耐鹽酵母提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：豆粕、炒小麥。

菌種：米曲霉滬釀3.042、假絲酵母菌(Candidaetchellsii，C酵母)為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 假絲酵母生長曲線測定

將活化后的假絲酵母菌株轉(zhuǎn)接至100 mL YPD無菌液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下?lián)u床(180 r/min)培養(yǎng)。每2 h取樣，利用可見分光光度計(jì)(波長660 nm)測定菌液吸光度，以生長時間為橫坐標(biāo)，吸光度(OD值)為縱坐標(biāo)，用軟件繪制假絲酵母菌的生長曲線。

1.2.2 HLFSS制曲工藝

1.2.2.1 種曲的制備

以麩皮∶水為1∶1.1的比例拌水，滅菌處理后接種3～4環(huán)孢子，在30 ℃恒溫堆積培養(yǎng)。15 h后振蕩打散曲料，然后調(diào)溫至30 ℃平鋪培養(yǎng)，7 h后第2次振蕩打散，3 d后將成熟種曲烘干備用。

1.2.2.2 大曲的制備

稱取原料500 g(其中豆粕與炒小麥比為6∶4)，豆粕經(jīng)(料液比為1∶1.1) 45 ℃無菌水浸泡30 min至充分吸水，隨后原料經(jīng)曲布包扎后進(jìn)行高壓滅菌處理。滅菌后將曲料及時打散，曲料溫度降到40 ℃時拌入種曲(原料質(zhì)量的0.4%)并充分混勻，在30 ℃堆積培養(yǎng)。12～16 h后第1次翻曲，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h第2次翻曲。28 ℃進(jìn)一步培養(yǎng)，培養(yǎng)40 h至大曲原料呈均勻的黃綠色，即為成曲。

1.2.3 發(fā)酵工藝

成曲收入發(fā)酵容器中，加入18%的鹽水(原料干重的2.5倍)攪拌均勻，封口進(jìn)行發(fā)酵，初始發(fā)酵溫度15 ℃，每天升高1 ℃，30 ℃封頂，共發(fā)酵150 d，發(fā)酵過程中定期攪拌。分別在發(fā)酵第15天、30天和45天添加假絲酵母菌，添加量為2×105CFU/g。

1.2.4 醬油發(fā)酵過程中pH值和總酸的測定

發(fā)酵過程中每15 d進(jìn)行一次取樣，直至第150天。取樣醬醪經(jīng)8000 r/min條件下離心6 min后得上清。取上述醬汁10 mL，用pH計(jì)直接讀數(shù)測定。總酸含量的測定按照國標(biāo)GB/T 5009.39-2003[6]規(guī)定的方法測定。

1.2.5 發(fā)酵結(jié)束后相關(guān)指標(biāo)的測定

1.2.5.1 液相色譜測定分析有機(jī)酸

色譜柱為Hydrosphere C18(250 mm×4.6 mm, I.D.)，流動相為0.03 mol/L KH2PO4(H3PO4調(diào)節(jié)pH值至3.0)，紫外檢測器波長為215 nm，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.5.2 固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC-MS)測定分析風(fēng)味物質(zhì)

GC條件：起始溫度40 ℃，持續(xù)10 min后，先以3 ℃/min升溫至100 ℃，然后以4 ℃/min升溫至180 ℃，最終以6 ℃/min升溫至220 ℃；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，以流速1 mL/min的氦氣為載氣，采用不分流進(jìn)樣的方式；MS條件：電離方式為EI，電子能量為70 eV，接口溫度為220 ℃，離子源溫度為230 ℃，掃描質(zhì)量范圍為33～450 amu[7]。

1.2.5.3 可溶性無鹽固形物含量的測定

依據(jù)國標(biāo)GB/T 18186-2000[8]中的方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 假絲酵母的生長特性研究

接種終濃度為106個/mL的假絲酵母于YPD培養(yǎng)基中，假絲酵母的生長曲線見圖1。從開始至4 h，假絲酵母生長處于初期，繁殖較遲緩；4 h后進(jìn)入對數(shù)期，生長繁殖速度較快，活力較旺盛；20 h后菌液生長進(jìn)入平穩(wěn)期。最終實(shí)驗(yàn)選取6～16 h的假絲酵母菌液進(jìn)行HLFSS的后續(xù)發(fā)酵。

圖1 假絲酵母生長曲線Fig.1 The growth curve of Candida

2.2 HLFSS發(fā)酵過程中酸類物質(zhì)相關(guān)理化指標(biāo)的測定

2.2.1 發(fā)酵過程中pH值和總酸含量的監(jiān)測

醬油在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH值逐漸下降，主要來自醬醪中產(chǎn)酸菌的繁殖，HLFSS通過醅鹽水的作用，非耐鹽菌逐漸死亡，耐鹽菌存活，耐鹽菌通過生長繁殖產(chǎn)生乳酸、琥珀酸等風(fēng)味有機(jī)酸類，適量的酸性物質(zhì)能夠中和HLFSS中的咸味，然而總酸含量過高也可能降低醬油的感官品質(zhì)[9-10]。

由圖2中(a)可知，HLFSS在發(fā)酵開始后，pH值偏中性，發(fā)酵體系中酶活力總體較高，醬油原料中的蛋白質(zhì)迅速被分解為多肽和氨基酸，并伴隨產(chǎn)生大量乳酸、乙酸等酸類物質(zhì)，使得pH值迅速下降；45 d后pH值的下降趨勢逐漸減緩，并最終趨于平緩。空白組的pH值維持在5.0～5.5之間，假絲酵母添加組的pH值維持在4.5～5.0之間。發(fā)酵結(jié)束時pH值大小關(guān)系如下：45 d+C<15 d+C<30 d+C<空白。由圖2中(b)可知，發(fā)酵開始后，總酸含量迅速增加，并在第90天時達(dá)到峰值，空白<30 d+C<15 d+C<45 d+C，分別為1.41，1.64，1.69，1.71 g/dL。發(fā)酵后期，有機(jī)酸被微生物利用生成酯類、醛類等風(fēng)味物質(zhì)，因此，發(fā)酵結(jié)束后的總酸含量為30 d+C<15 d+C<45 d+C<空白。

圖2 HLFSS發(fā)酵過程中pH值的變化(a)和總酸的變化(b)Fig.2 The changes of pH values (a) and total acids (b) of HLFSS in the fermentation process

2.2.2 發(fā)酵結(jié)束后有機(jī)酸含量的測定

2.2.2.1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

混合10種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，液相色譜圖見圖3，出峰順序依次為：1-草酸、2-酒石酸、3-甲酸、4-蘋果酸、5-乳酸、6-乙酸、7-檸檬酸、8-富馬酸、9-琥珀酸、10-丙酸。10種有機(jī)酸的回歸方程見表1。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸混合溶液液相色譜圖Fig.3 The chromatogram of standard organic acid mixed solution

表1 有機(jī)酸回歸方程Table 1 The regression analysis of organic acids

2.2.2.2 10種有機(jī)酸含量的測定

醬油的香氣主要來自有機(jī)酸含量的高低，而且有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)HLFSS高鹽分帶來的不適口感。醬油中的有機(jī)酸以乳酸、乙酸為主。本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜法進(jìn)行檢測與分析，各個發(fā)酵組的有機(jī)酸含量見表2，各發(fā)酵組有機(jī)酸種類基本一致，其中草酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸含量較高。琥珀酸入口呈爽口酸味；乙酸等在烹飪過程中可與醇類等反應(yīng)，生成具有特殊風(fēng)味的酯類；乳酸能適當(dāng)提高醬油的酸度，賦予其綿長細(xì)膩的口感，也是風(fēng)味物質(zhì)乳酸乙酯的前體物質(zhì)；草酸含量過量會危害人體健康，各組草酸含量均在國標(biāo)范圍內(nèi)[11]。

表2 各組有機(jī)酸的含量Table 2 The content of organic acids in each group

由表2可知，各個發(fā)酵組中，有機(jī)酸含量依次為空白<30 d+C<15 d+C<45 d+C，除了蘋果酸和琥珀酸外，45 d+C組有機(jī)酸含量最高，45 d+C組有機(jī)酸液相色譜圖見圖4。

圖4 45 d+C組有機(jī)酸液相色譜圖Fig.4 The chromatogram of organic acids in 45 d+C group

2.3 發(fā)酵結(jié)束后醬油品質(zhì)的測定

2.3.1 風(fēng)味物質(zhì)的檢測

通過氣質(zhì)質(zhì)譜檢測到各個發(fā)酵組的主要風(fēng)味物質(zhì)種類，見表3。發(fā)酵結(jié)束后各組所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)大約有53～73種，其中種類數(shù)目最多的是45 d+C組，為73種。在所有風(fēng)味物質(zhì)中，構(gòu)成醬油風(fēng)味的骨架體系為醇類、酯類和酚類，酯類物質(zhì)所占比重最大[12]，而有機(jī)酸是酯類的前體物質(zhì)，酯類物質(zhì)不僅能增強(qiáng)醬油的香味，還能緩和醬油的咸味，對比各發(fā)酵組，45 d+C組酵母的酯類物質(zhì)種類最多，為25種。醬油中的醇類以乙醇為主，它是在耐鹽酵母作用下由糖類物質(zhì)生成的，其中一部分會隨溫度升高而揮發(fā)，一部分會被氧化成酸類，一部分與有機(jī)酸及氨基酸生成酯類，殘留部分是醬油清爽香氣的來源[13]。酚類是醬油香氣的重要成分，以烷基酚類為主，但是其含量過高易使人感覺有中藥的氣味。醬油中醛類物質(zhì)含量較低，大部分是由氨基酸脫胺基、脫羰基生成，種類有甲醛、乙醛、丙醛、異丁醛、異戊醛等，具有辛辣刺激性氣味，微量的醛類可以提高醬油的口感[14]。

表3 各組中的風(fēng)味物質(zhì)比較Table 3 The comparison of volatile substances in each group

2.3.2 可溶性無鹽固形物含量的測定

衡量高鹽稀態(tài)醬油品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)是可溶性固形物的含量[15]。由圖5可知，發(fā)酵結(jié)束后各組無鹽固形物的含量均在14.00～16.00 g/dL，滿足國標(biāo)(可溶性無鹽固形物含量≥13.00 g/dL)規(guī)定的高鹽稀態(tài)一級醬油的標(biāo)準(zhǔn)。其中添加假絲酵母的發(fā)酵組均達(dá)到了特級醬油(≥15.00 g/dL)的標(biāo)準(zhǔn)，45 d+C組最高，達(dá)到15.72 g/dL，其次分別是15 d+C組、30 d+C組。

圖5 各組可溶性無鹽固形物含量的對比Fig.5 The comparison of content of soluble salt-free solids in each group

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)不同時間添加假絲酵母影響HLFSS中酸類物質(zhì)的含量和種類。在第45天添加假絲酵母后，發(fā)酵結(jié)束后的總酸、有機(jī)酸含量在各組中數(shù)值均最大，且經(jīng)液相檢測45 d+C組酸類物質(zhì)種類最多。通過氣質(zhì)質(zhì)譜檢測風(fēng)味物質(zhì)種類以及對可溶性無鹽固形物的測定說明45 d+C組的醬油品質(zhì)最高。假絲酵母通過增加有機(jī)酸含量提高HLFSS品質(zhì)，有機(jī)酸含量可作為HLFSS品質(zhì)評價的依據(jù)。在今后的研究中，我們可以研究添加不同種類的耐鹽酵母，根據(jù)它們各自的優(yōu)勢，為企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油提供更多的理論依據(jù)。