添加糖和乳酸菌對東北酸菜發酵效果的影響

何家樂，吳幻，劉夢綺，李勁，姜博文，吳昊，楊洪巖

(東北林業大學 生命科學學院，哈爾濱 150040)

酸菜是我國東北地區的傳統發酵蔬菜，傳統腌制方法是將新鮮白菜洗凈后，浸入裝有鹽水的陶缸中，碼至頂端后用腌菜石壓實,經過30 d左右的自然發酵即可食用。隨著生活節奏的加快，酸菜傳統的小家小戶制作已經逐漸向規模化、商業化過渡。目前的商業化酸菜生產仍然主要依靠自然發酵，普遍存在發酵周期長和質量不穩定等問題[1]。

微生物是引起蔬菜發酵體系一系列物理化學變化的主要因素[2]，控制發酵體系的微生物才能從根本上控制發酵周期和發酵產品質量。在我們之前的研究中，已經對酸菜發酵體系中的微生物進行了系統解析，結果顯示：在酸菜發酵體系中包含Acinetobactersp.，Pseudomonasfragi,Klebsiellasp.,Citrobactersp.,Betaproteobacteriasp.和乳酸菌等微生物種屬，Leuconostocmesenteroides,Lactobacilluscurvatus,L.plantarum和L.oligofermentans是發酵中的主體微生物[3]。通過研究發現接種Lactobacillus在發酵體系內占據主導，顯著加速發酵進程和提高發酵質量[4-5]。

碳水化合物是所有活生物體中細胞碳和能量的主要來源。乳酸菌是酸菜發酵中的主要微生物[6]，可以利用各種可溶性碳水化合物作為底物生產有機酸。因此，添加碳水化合物有利于乳酸菌的生長。在制作酸菜時，當乳酸菌接種劑不易獲得時，經驗上會向發酵體系內添加糖，以營造利于酸菜本源乳酸菌生長的環境，從而加速發酵進程，然而加糖對發酵體系理化及微生物產生的影響尚不明確。在本研究中，為了明確在酸菜發酵過程中添加糖對發酵體系的影響，設置不添加對照、添加蔗糖處理和添加乳酸菌3個處理，通過對發酵體系理化及微生物學特征的研究明確加糖對發酵體系的影響，為酸菜的規模化生產提供了技術指導。

1 材料與方法

1.1 接種與發酵

白菜發酵參照參考文獻[5]所描述的方法。簡要描述如下：收獲白菜，風干萎蔫2 d，修剪、清洗后層層碼入250 L陶缸中，然后用腌菜石壓實，鹽與糖或菌劑隨水加入陶缸中，鹽的添加比例為總白菜重的1%(W/W)，糖的添加比例為總白菜重的0.5%(W/W)。對于乳酸菌接種處理，根據課題組前期的研究成果，選用Lactobacilluscurvatus與Lactobacillusoligofermentans混合接種劑處理。兩菌株在優勢培養基上培養24 h(OD600=1.5)后，以5800×g離心3 min，除去上清液后，將細胞重懸于無菌蒸餾水中，并以3∶1的比例混合。接種率為1×106菌落形成單位(CFU)/g新鮮白菜。所有處理設3次重復，于18 ℃下發酵30 d，分別在發酵的第0，6，12，18，24，30天進行采樣。

1.2 取樣

在每個取樣時間點，從陶缸表面下第3層取出白菜，用榨汁機勻漿后取汁液約0.5 mL用于微生物菌落計數；取30 mL于4 ℃下5800×g離心10 min后，將所得沉淀重懸于2 mL提取緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl和40 mmol/L EDTA，pH 9.0)中。將每處理3個重復樣品合于一管，凍存于-20 ℃用于DNA提取及后續高通量測序分析。離心所得上清液(0.7 mL)加入0.3 mL乙腈(高效液相色譜(HPLC)級，Dikma，加利福尼亞州萊克福里斯特，美國)，渦旋后，靜置10 min，隨后10800×g離心10 min，用0.22 μm過濾器過濾，上清液保存在-20 ℃，用于HPLC分析。取白菜由外向內數第二層葉片，于105 ℃烘干粉碎過2 mm目篩，用于可溶性糖(WSC)的測定。

1.3 微生物計數與理化指標分析

乳酸菌和一般細菌菌落計數采用平板稀釋法。乳酸菌在MRS[7]瓊脂上30 ℃培養2 d，其他一般細菌在營養瓊脂上在37 ℃培養2 d。使用pH計(B-212，Horiba，Kyoto，日本)進行pH測量。可溶性糖采用蒽酮比色法[8]。有機酸采用高效液相色譜(HPLC)法(Waters，Milford，MA，美國)。使用高親和力陽離子交換柱(Aminex HPX-87H，300 mm×7.8 mm，Bio-Rad，Hercules，CA，美國)進行色譜分離。柱溫為40 ℃，流速為0.6 mL/min，流動相中的H2SO4濃度為5 mmol/L，所有樣品均運行30 min。使用R軟件進行統計分析。顯著性水平為p<0.05。

1.4 DNA提取和高通量測序

總DNA的提取采用試劑盒法(Omega,USA)。建庫引物選擇515F(5＇-GTGCCAGCMGCCGCGG-3＇)和907R(5＇-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3＇)[9]。利用雙末端測序(Paired-End)法構建小片段測序文庫，質檢合格后用MiSeq Illumina測序平臺測序(美吉生物有限公司，上海，中國)。

1.5 數據處理及生物信息學分析

使用QIIME處理和分析高通量測序數據。基于QIIME中的Uchime算法[10]，使用Usearch刪除嵌合序列。按97%的序列相似性進行操作分類單元(OTU)劃分。使用QIIME軟件對樣本的Alpha多樣性指數(Ace，Chao 1，Shannon，Simpson和Coverage)進行分析。此外，使用R軟件的Vegan包進行了主成分分析。原始序列數據NCBI數據庫登錄號為SRX1078336。

2 結果與分析

2.1 酸菜發酵過程中的pH動態

本研究設置3個處理，無添加對照、添加蔗糖處理和添加乳酸菌處理。3個處理的pH動態見圖1。在發酵開始時，加糖和乳酸菌處理的pH值下降速度均快于對照(p<0.05)。從發酵的第6天起，加糖處理的pH低于對照的pH(p<0.05)，并且在整個發酵期間均顯著低于其他處理(p<0.05)。

圖1 酸菜發酵pH動態Fig.1 The pH values' dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無添加對照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。

2.2 酸菜發酵過程中的有機酸動態

利用HPLC檢測到的乳酸、乙酸和丙酸動態見圖2。

圖2 酸菜發酵過程中的有機酸動態Fig.2 The organic acids' dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無添加對照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。A表示乳酸，B表示乙酸，C表示丙酸。

添加LAB處理乳酸水平最高。蔗糖添加處理中的乳酸水平高于對照，但低于乳酸菌接種處理(p<0.05)。在發酵的前12 d，對照中的乙酸水平最高，隨后是加糖處理(p<0.05)。乳酸菌接種處理中的乙酸水平在整個發酵期間最低。在本研究中還檢測到丙酸，隨著發酵的進行，丙酸的濃度增加。在第30天時，所有處理丙酸的濃度大于1.0 g/L。

2.3 酸菜發酵過程中的微生物菌落動態

使用平板稀釋法進行微生物菌落計數，見圖3。在發酵的前12 d，乳酸菌增加明顯(p<0.05)，此后各處理之間的乳酸菌變化不再顯著。在發酵的第6天，對照中的乳酸菌明顯少于其他處理(p<0.05)。在所有處理中，經過18 d的發酵，一般細菌的數量均顯著減少(p<0.05)。直至第24天，所有處理的一般細菌數量沒有顯著差異。

圖3 酸菜發酵過程中的微生物菌落動態Fig.3 The microbial colonies' dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無添加對照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。A表示乳酸菌，B表示一般細菌。

2.4 酸菜發酵過程中的可溶性糖動態

發酵體系對可溶性糖(WSC)的消耗見圖4。在發酵的第6～30 d，可溶性糖的水平顯著下降，最明顯的變化發生在前18 d。添加乳酸菌處理的WSC下降最快(p<0.05)。在第30天時，WSC的濃度約為3.0 g/100 g干物質。

圖4 酸菜發酵過程中的可溶性糖動態Fig.4 The soluble sugar's dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無添加對照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。WSC表示可溶性糖，DM表示干物質。

2.5 門、屬水平上的微生物群落組成

通過高通量測序分析，總共獲得了247850個有效序列，每個樣品的平均值為16523(標準差=4616)。物種豐富度Alpha多樣性指數見表1。每種處理的生物分類組成見圖5(A為門水平，B為屬水平)。

表1 酸菜樣品OTU豐富度、樣品覆蓋度和多樣性指數Table 1 The OTU richness, sample coverage rates and diversity indexes of sauerkraut samples

圖5 細菌門水平、屬水平的群落組成多樣性Fig.5 The community composition diversity at phylum level and genus level注：未鑒定出的序列統一標記為No_Rank；Control表示無添加對照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理。

由圖5可知，在這3種處理中，檢測到的門包括Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes，Actinobacteria，Cyanobacteria，Fusobacteria和Verrucomicrobia等。在所有處理中，Firmicutes和Proteobacteria占據優勢。在乳酸菌接種處理中，厚壁菌門優勢最為明顯。

在屬水平上，主要檢測到Lactobacillus，Lactococcus，Enterobacter，Pseudomonas，Leuconostoc，Enterobacteriaceae_unclassified，Acinetobacter和Arcobacter。在對照中，Lactobacillus，Lactococcus，Pseudomonas，Leuconostoc和Enterobacteriaceae是主要菌屬；在乳酸菌接種處理中，Lactobacillus占據絕對優勢。在對照處理中，在發酵的第30天，Lactococcus的最高比例達到29.7%，在發酵的第18天，Lactobacillus的最高比例達到45.9%。在發酵的第12天，Leuconostoc的最高相對含量達4.6%。在乳酸菌接種處理中，在發酵的第12天，Lactobacillus的相對豐度達到66.4%，之后Lactobacillus的比例達到≥80%以上。

在糖添加處理中，Lactobacillus的相對豐度在發酵過程中不斷增加。在發酵的第30天，Lactobacillus的相對豐度從第6天的13.8%增加到54.7%。在發酵的前18 d，Lactococcus的比例持續增加，最大值達到22.9%，在發酵第30天比例下降到9.9%。在加糖處理中，Enterobacter比例比其他處理高，在發酵第6天的相對豐度為39.3%，在發酵第30天其相對豐度為14.1%。加糖處理中Leuconostoc的比例也是所有處理中最高的，其最大值為12.7%。

通過PCA分析，比較了3個處理中15個樣品的細菌群落結構，見圖6。

圖6 酸菜樣品發酵過程中的細菌群落主成分分析Fig.6 The principal component analysis of bacterial colonies of sauerkraut samples during fermentation注：Control表示無添加對照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理。

由圖6可知，無添加處理和乳酸菌接種處理在PC1軸分開，說明接種微生物可以解釋兩處理菌落組成不同的54.08%；加糖處理與對照處理在PC2軸分開，說明加糖處理可以解釋兩處理微生物群落結構差異的21.39%；除第6天樣品外，接種處理與加糖處理在PC2軸分開，表明接種和加糖處理對于發酵后期微生物結構的影響更為顯著。

3 討論

3.1 加糖酸菜發酵的理化動態解析

由于地域和季節不同，世界各地生產的發酵蔬菜的種類也存在很大差異，但發酵作為蔬菜的保藏方式由來已久[11]。與其他類型的發酵食品一樣，發酵蔬菜內含有各種微生物，乳酸菌在整個發酵過程中起著主導作用。它們代謝原材料的化學成分，以改善風味和材料質地并幫助提高消化率。此外，乳酸菌還可以產生抑菌化合物從而顯示益生特性[12]。我們以前的研究顯示，在傳統自然發酵過程中，pH值和可溶性糖含量的下降主要發生在發酵的前12 d，乳酸積累主要發生在前18 d，在第12天觀察到乙酸濃度的增加。在本研究中，對照的發酵是自發的，其發酵的理化變化與先前的研究一致。然而，與對照相比，其他兩種處理的理化變化更為劇烈。蔬菜發酵過程中發生的物理化學變化是由微生物變化引起的[13]，所以不同處理理化變化不同的結果表明添加乳酸菌或蔗糖會顯著影響微生物的代謝能力及水平。

3.2 基于高通量測序的微生物多樣性分析

基于傳統分離培養技術鑒定微生物多樣性存在很多局限，從樣品中直接提取核酸后進行高通量測序已經成為分析自然生態系統中微生物多樣性的重要工具[14]。在本研究中，通過高通量測序分析了酸菜中細菌群落的多樣性。在門的水平上，主要包括Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes，Actinobacteria，Cyanobacteria，Fusobacteria和Verrucomicrobia等(見圖5)。通常在水果、蔬菜和發酵乳中檢測到Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes和Actinobacteria等[15-16]，而Cyanobacteria和Fusobacteria在海草、植物的根系中多有發現[17]，Verrucomicrobia在瘤胃中更為常見[18-19]，這些結果說明酸菜發酵體系中微生物群落多樣性豐富。在屬水平上，檢測到了Lactobacillus，Lactococcus，Enterobacter，Pseudomonas，Leuconostoc，Enterobacteriaceae_unclassified，Acinetobacter和Arcobacter等，該結果與我們先前對自發酸菜發酵過程中細菌屬的研究一致。在較低水平檢測到的其他屬包括Weissella，Aeromonas，Comamonas，Saccharibacillus，Shewanella，Kluyvera，Flavobacterium，Chryseobacterium，Janthinbacterium，Aquabacterium和Rhodococcus。

3.3 接種微生物和加糖對酸菜發酵微生物動態的影響

在蔬菜和水果的發酵過程中，控制乳酸發酵的方法主要有兩種：使用本源或異源發酵劑。從水果和蔬菜附著的本源微生物中選擇發酵菌種更值得推薦，因為本源菌在延長保質期、改善制品營養和感官特性方面更具有優勢[20]。本研究中所用的乳酸菌接種劑來源于酸菜本身。接種后，可以迅速在發酵體系內定殖，使Lactobacillus成為最主要屬。

每個植物物種都有特定優勢和恒定的微生物群[21]。乳酸菌是蔬菜原材料上的本源菌群的一小部分(2.0～4.0 log CFU/g)[22]。已從不同類型的蔬菜中鑒定到Leuconostoc，Lactobacillus，Weissella，Enterococcus和Pediococcus等異型發酵和同型發酵種。當條件合適時，新鮮蔬菜可能會自發進行乳酸發酵。對于酸菜發酵，主要的微生物是乳酸菌。乳酸發酵的底物是WSC，葡萄糖、果糖和蔗糖是其中的典型代表[23]。在本研究中，我們將蔗糖添加到發酵系統中以觀察其對微生物群落的影響。在添加蔗糖處理中，各種細菌屬的相對豐度與對照相比顯著不同。Lactobacillus的相對豐度在整個發酵過程中持續增加，在第30天約占細菌總數的54.7%。Lactococcus，Enterobacter，Leuconostoc特別是Enterobacter顯著增加，腸桿菌屬兼性厭氧菌，在發酵開始時即已啟動。腸細菌種類的相對豐度在第6天最高(39.3%，見圖5)，但到第30天已開始下降(相對豐度為14.1%)。已有研究表明，未加工的蔬菜中可能存在凝固酶陽性葡萄球菌和其他腸細菌，其細胞密度低，由于面臨微生物競爭而使生長受到抑制，在某些特殊情況下可能致病[24]。因此綜合本研究結果，加糖與添加乳酸菌兩種處理比較，接種乳酸菌可以更好地控制酸菜發酵，獲得相對更安全的酸菜產品。

4 結論

在本研究中，為了明確加糖對酸菜發酵效果的影響，將乳酸菌或蔗糖添加到發酵體系中，分析發酵體系的理化及微生物動態。從理化指標來看，添加乳酸菌或蔗糖可以更快地降低發酵系統的pH。接種乳酸菌處理乳酸的濃度更高。微生物分析表明，乳酸菌接種劑可以在發酵系統中棲息并占主導地位。蔗糖的添加一定程度上支持腸桿菌的生長，加糖與加乳酸菌比較，接種乳酸菌更有利。本研究結果為東北酸菜生產的規模化、規范化提供了技術參考。