超聲波協同復合酶提取花椒麻味物質工藝的優化

周敏，蒲升慧，劉福權，趙志峰，呂遠平

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)是蕓香科花椒屬植物，全世界約有250個花椒品種[1]。花椒在我國具有廣泛的應用和悠久的栽培歷史，它是中國烹飪文化和四川美食的傳統調味品之一，具有獨特的麻味[2-3]。據研究報道，花椒中的化學成分包括生物堿類、酰胺類、揮發油、木脂素、香豆素、黃酮類及多酚類等[4-6]，花椒的刺痛感和麻木感是由酰胺類物質即麻味物質所引起的，它是評價花椒品質的重要指標[7]。目前，溶劑提取法廣泛應用于麻味物質的提取，但存在著提取時間長、提取率低或費用高等缺點[8-9]。研究者報道了超聲波技術[10]和酶法[11]可用于花椒麻味物質的提取工藝，超聲波利用其空化作用和機械效應對原料進行破碎，促進胞內的麻味物質擴散、溶出；酶能夠水解纖維素，促進麻味物質的溶出，并且多種酶混合使用可能具有協同作用，提取效率優于單一酶處理[12]。超聲波協同復合酶法能有效避免常規溶劑提取法的缺陷，但對于超聲波協同復合酶提取麻味物質的研究還未見相關報道。

因此，本文在傳統溶劑提取法的基礎上增加超聲波與復合酶處理，采用混料設計與響應面設計優化花椒麻味物質的提取工藝，以達到高效提取花椒麻味物質的目的，實現花椒資源的高效利用。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

實驗原料：干燥的紅花椒果皮，收獲于2019年9月，由四川五豐黎紅食品有限公司提供。將其粉碎過40目篩，并存放于-18 ℃冰箱備用。

主要試劑：纖維素酶(EC 3.2.1.4，50 U/mg)、半纖維素酶(EC 3.2.1.78，20 U/mg)、果膠酶(EC 3.2.1.15，500 U/mg)：均為分析級，購于源葉生物科技有限公司；食用酒精(95%)：購于河南鑫河陽酒精有限公司；戊二醛和磷酸：均為分析試劑，購于成都市科龍化工試劑廠。

主要儀器：SHA-B水浴恒溫振蕩器 江蘇金城國勝實驗儀器廠；KQ-300VD三頻數控超聲波清洗機 昆山禾創超聲儀器有限公司；RE-5299旋轉蒸發儀 上海道京儀器有限公司；TD25-WS離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀 日本島津公司；JSM-7500F場發射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社(JEOL)。

1.2 實驗方法

1.2.1 花椒麻味物質的提取工藝

50 g花椒粉經500 mL超純水蒸餾提取后，過濾料液并收集花椒殘渣，稱其重量記為M1。取20 g花椒殘渣和200 mL超純水混合并在恒溫振蕩培養箱中水解3 h，溫度控制在(40±1) ℃，pH 4.8±0.2(采用10 mg/mL檸檬酸進行調節)。水解完成后，加入200 mL食用酒精，在(50±1)℃條件下浸提3 h，減壓抽濾并收集濾液，經減壓蒸干后，收集剩余成分，即麻味粗提物。向麻味粗提物中加入100 mL食用酒精，振蕩使其溶解后于4000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，再通過減壓蒸干收集浸膏狀成分，即麻味物質，稱其重量記為M2。麻味物質提取率的計算公式如下：

麻味物質提取率(%，W/W)=[(M1×M2)/(20×50)]×100。

(1)

1.2.2 花椒麻味物質提取工藝優化

1.2.2.1 復合酶混料設計

利用Design-Expert 8軟件中混料設計(單行格子設計{3,2})篩選纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的最佳配比，以3種酶的占比為自變量，麻味物質提取率為響應值。混料設計實驗因素水平見表1。

表1 混料設計實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of mixture design test

1.2.2.2 響應面實驗

通過Plackett-Burman實驗[13]篩選出影響麻味物質提取率的顯著性因素為：酶添加量、酶處理溫度和超聲功率。

a.單因素實驗

酶添加量：在酶處理溫度40 ℃，pH 4.8，酶處理時間3 h，超聲功率120 W，超聲時間30 min的條件下，考察酶添加量(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)對麻味物質提取率的影響。

酶處理溫度：在酶添加量3.0%，pH 4.8，酶處理時間3 h，超聲功率120 W，超聲時間30 min的條件下，考察酶處理溫度(40，45，50，55，60 ℃)對麻味物質提取率的影響。

超聲功率：在酶添加量3.0%，在酶處理溫度50 ℃，pH 4.8，酶處理時間3 h，超聲時間30 min的條件下，考察超聲功率(120，150，180，210，240，270，300 W)對麻味物質提取率的影響。

b.Box-Behnken中心組合實驗優化

在單因素實驗結果基礎上，根據Design-Expert 8軟件中Box-Behnken中心組合實驗設計原理，以酶添加量、酶處理溫度和超聲功率為自變量，麻味物質提取率為響應值，在三因素三水平實驗上優化得出工藝最佳參數[14]，因素水平設計見表2。

表2 響應面實驗因素水平表Table 2 The factors and levels of response surface analysis design

1.2.3 掃描電鏡實驗

花椒樣品用2.5%戊二醛溶液固定靜置12 h，然后利用pH 6.8, 0.1 mol/mL的磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min，最后用不同溶度梯度(40%、60%、80%、90%、100%)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每次10 min。再將脫水后的樣品進行臨界點干燥，然后用膠帶固定，并進行噴金處理，最后利用掃描電鏡進行觀察。

2 結果與分析

2.1 復合酶混料設計實驗結果

由表3可知，使用果膠酶可以提高麻味物質的提取率，而纖維素酶或半纖維素酶則無此現象，這可能與纖維素、半纖維素和果膠在花椒細胞中的組成有關。此外，纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶在麻味物質提取中可能具有協同作用，與對照組和單一酶處理組相比，按一定比例復配的復合酶可顯著提高麻味物質的提取率。纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶三者間配比與麻味物質提取率間關系可用多項式方程進行擬合，表示為Y=10.07X1+9.43X2+10.68X3+0.032X1X2+6.44X1X3-0.27X2X3+81.90X1X2X3。

表3 混料設計實驗方案及結果Table 3 The experimental scheme and results of mixture design

由表4可知，該模型特征值中P>0.05，失擬項不顯著，且R2值為0.9405，說明此方程擬合有效，可對不同酶配比條件下麻味物質提取率進行分析和預測。

表4 混料設計實驗結果統計學分析Table 4 The statistical analysis for the results of mixture design

由圖1可知，3種酶的配比對麻味物質提取率有顯著影響，等高線越靠近中心其形狀越接近于橢圓，此時3種酶的交互作用顯著。因此,通過回歸方程得出復合酶的最佳配比為纖維素酶36.2%、半纖維素酶26.0%和果膠酶37.8%，此時預測麻味物質提取率為13.94%。

圖1 復合酶交互作用對麻味物質提取率影響的等高線圖和響應面圖Fig.1 The contour plot and response surface plot of the effect of compound enzymes interaction on the extraction rates of numb-taste components

驗證實驗結果表明，麻味物質提取率為(13.27±0.28)%，與回歸模型預測值無顯著差異。因此,纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的最佳配比結果真實有效。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 單因素實驗結果

3個顯著性因素對麻味物質提取率影響的單因素實驗結果見圖2。

圖2 酶添加量(a)、酶處理溫度(b)和超聲功率(c)對麻味物質提取率的影響Fig.2 The effects of enzyme additive amount (a), enzyme treatment temperature (b) and ultrasonic power (c) on the extraction rates of numb-taste components

由圖2可知，3個因素的較優參數分別為：酶添加量3.0%，酶處理溫度50 ℃，超聲功率210 W。

2.2.2 Box-Behnken中心組合實驗結果

運用Design-Expert 8軟件對實驗結果進行分析，得到因變量與自變量之間的二項式擬合方程：Y=15.64+0.28A+0.18B-0.06C-0.29AB+0.17BC- 0.76A2-1.10B2-0.50C2+0.49AB2-0.10B2C。進一步對回歸模型進行方差分析，結果見表5。

表5 響應面優化實驗結果統計學分析Table 5 The statistical analysis for the results of response surface analysis design

由表5可知，二項式擬合模型具有極顯著性(P<0.0001)，模型修正系數R2=0.9942，說明該模型預測值與實驗的實際值擬合較好；失擬項P值為0.4237(P>0.05)，失擬項不顯著，表明方程模型誤差較小[15]。根據回歸分析結果，分別固定一個自變量的中間值，繪制因變量隨自變量變化的響應曲面圖(見圖3)。發現酶添加量與酶處理溫度的交互作用較顯著，而酶添加量與超聲功率和酶處理溫度與超聲功率的交互作用不顯著。因此，對回歸模型進行優化分析得到麻味物質提取的最佳工藝參數為：酶添加量3.08%、酶處理溫度50.3 ℃和超聲功率208.5 W，此時麻味物質的提取率為15.67%。

圖3 各因素交互作用對麻味物質提取率影響的等高線圖和響應面圖Fig.3 The contour plots and response surface plots of the effects of interactions of various factors on the extraction rates of numb-taste components注：A為酶添加量與酶處理溫度；B為酶處理溫度與超聲功率；C為酶添加量與超聲功率。

2.2.3 驗證實驗

在上述優化的最佳工藝下進行驗證實驗，得出麻味物質提取率為(15.14±0.54)%，與回歸模型預測值無顯著差異。因此該模擬結果真實有效，在此條件下花椒麻味物質提取率從10.24%提升到15.14%。

2.3 掃描電鏡結果

2.3.1 不同酶處理后花椒細胞掃描電鏡結果

掃描電鏡圖(見圖4)顯示了未處理樣品和不同酶處理樣品的花椒細胞破碎情況。

圖4 不同酶處理后花椒細胞電鏡掃描圖Fig.4 The scanning electron microscopy of Zanthoxylum bungeanum cells treated with different enzymes注：A為對照組；B為纖維素酶組；C為半纖維素酶組；D為果膠酶組；E為復合酶組。

由圖4中A可知，未處理的花椒細胞中雖然出現大量皺縮情況，但是細胞結構較為完整，無大量細胞壁破裂現象。而經過纖維素酶(見圖4中B)、半纖維素酶(見圖4中C)、果膠酶(見圖4中D)和復合酶(見圖4中E)處理后的花椒細胞均出現大量細胞破裂現象，且細胞表面可見明顯破裂碎片。值得注意的是，復合酶處理后，花椒細胞破裂情況最為嚴重，細胞出現大量孔洞。因此表明與未處理組相比，使用酶處理均能破壞花椒的細胞結構，并且纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的混合使用可能具有協同作用，從而增強對花椒細胞結構的破壞。

2.3.2 不同方法處理后花椒細胞掃描電鏡結果

掃描電鏡圖(見圖5)顯示了不同方法處理后花椒細胞破裂情況。

圖5 不同方法處理后花椒細胞電鏡掃描圖Fig.5 The scanning electron microscopy of Zanthoxylum bungeanum cells with different treatment methods注：A味精對照組；B為復合酶組；C為超聲組；D為復合酶與超聲組。

由圖5中A可知，未處理的花椒細胞中雖然出現大量皺縮情況，但是細胞結構較為完整，無大量細胞壁破裂現象。復合酶處理后(見圖5中B)，花椒細胞結構明顯被破壞，細胞壁出現不規則鋸齒狀邊緣，細胞空隙變大。超聲波處理后(見圖5 中C)，花椒細胞壁破裂，出現大量可見碎片，并且細胞間出現較大的撕裂斷痕。此外，經過超聲波與復合酶共同處理的花椒細胞(見圖5中D)破壞最為嚴重，不僅細胞壁破裂形成小碎片，而且在細胞間還出現巨大破裂孔洞。因此，與未處理組相比，使用復合酶處理、超聲處理和超聲波與復合酶共同處理均能破壞花椒細胞結構，并且超聲波與復合酶共同處理可能具有協同作用，從而增強對花椒細胞結構的破壞。

3 結論

本文為提高傳統提取方式下花椒麻味物質的提取率，采用超聲波協同復合酶處理提取花椒中的麻味物質。通過混料設計、單因素實驗和Box-Behnken中心組合設計得到最佳的提取工藝條件：酶添加量3.08%，酶處理溫度50.3 ℃和超聲功率208.5 W。掃描電鏡實驗解釋了麻味物質提取率提高的原因，超聲波協同復合酶處理可能存在協同作用，使花椒細胞結構破壞得更加徹底，有利于麻味物質溶出。因此，超聲波協同復合酶處理作為改進后的工藝，與傳統的提取工藝相比具有顯著的優勢，有效地提高了花椒風味物質的提取率，可為進一步開發和利用花椒中的麻味物質提供理論依據。