豆渣中可溶性多糖的不同提取方法比較和工藝優化

傅晶依，石曾卉，湯琦龍，劉云，王靜，趙晨皓，趙珺*

(1.長春大學 食品科學與工程學院，長春 130022；2.吉林大學 臨床醫學院，長春 130012；3.榆樹市榆鄉豆制品有限公司，長春 130400)

大豆(soybean)富含植物蛋白、大豆異黃酮、膳食纖維等多種對人體有益的成分，其營養和經濟價值都很高。大豆作為中國最重要的糧食作物之一，在我國的生產和消耗量是巨大的。而在大豆加工分離蛋白、豆粉、豆漿、豆腐等產品的過程中，會產生大量的副產物——豆渣。豆渣(soybean residue，SR)由于水分含量特別大，極易產生腐敗變質等問題[1]。目前我國對豆渣的處理利用僅限于用作飼料或肥料甚至直接廢棄，造成了極大的資源浪費與環境污染問題。

多糖(polysaccharide)廣泛存在于自然界中，是由中性糖與糖醛酸通過糖苷鍵連接在一起的長鏈復雜碳水化合物[2]，作為植物細胞的主要結構物質之一，具有抑菌性、抗腫瘤、改善免疫力等生理活性[3-4]，因此在結構和功能上都具有很高的研究價值，已成為近些年的研究熱點。研究表明，豆渣中包含大約30%可溶性大豆多糖，并且是酸性多糖[5]。在食品加工中，常被用作穩定劑、乳化劑、澄清劑、強化劑、食品特性改善劑等來提高食品的食用品質特性[6]。

現階段，國內多采用熱水浸提、酸堿水解提取、超聲輔助提取等方法從大豆中提取水溶性大豆多糖[7]。本文以豆渣為原料，優化超聲輔助提取法與復合酶解提取法的工藝條件，并對比兩種提取方法，以期找到提取豆渣中可溶性多糖的最佳方法，為合理利用豆渣、提高大豆利用率提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣：由榆樹市榆鄉豆制品有限公司提供；苯酚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸、濃硫酸：分析純，北京化工廠；纖維素酶、酸性蛋白酶：食品級，河南萬邦實業有限公司；氨基磺酸、間羥基聯苯：分析純，范德(北京)生物科技有限公司；三氟乙酸：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器

DZKW-172電熱恒溫水浴鍋 天津天泰儀器有限公司；FA1104N電子天平、3K15高速冷凍離心機 上海精密科學儀器有限公司；KQ5200DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上海博迅實業有限公司；721型分光光度計 上海佑科儀器有限公司；LC-10AT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 工藝流程

1.3.1 超聲輔助提取法工藝流程

一定質量干豆渣→加蒸餾水→超聲波→熱水浸提→過濾去渣→濃縮醇沉→離心干燥→可溶性粗多糖。

1.3.2 復合酶解提取法工藝流程

一定質量干豆渣→加蒸餾水→調pH至4.0→加入復合酶(纖維素酶∶蛋白酶為1∶1)→熱水浸提→高溫滅活→過濾去渣→濃縮醇沉→離心干燥→可溶性粗多糖。

1.4 多糖得率計算

稱量干燥后所得可溶性粗多糖粉末的質量，依據公式(1)計算多糖得率。

(1)

1.5 多糖溶解量測定

取多糖粉末10 mg溶解于1 mL蒸餾水中，振蕩10 min，8000 r/min高速離心10 min后烘干至恒重，依據公式(2)進行計算。

(2)

1.6 總糖含量與糖醛酸含量測定

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，將多糖樣品配制成0.1 mg/mL多糖溶液，取0.6 mL至試管中，加蒸餾水補足1 mL，向試管中加入0.5 mL 6%的苯酚溶液，2.5 mL濃硫酸，振蕩搖勻靜置反應30 min，于490 nm處測吸光值，重復3次，計算樣品中總糖含量。

糖醛酸的測定采用間羥基聯苯法，將多糖樣品配制成0.1 mg/mL多糖溶液，取0.4 mL至試管中，加入氨基磺酸40 μL，濃硫酸2.5 mL，振蕩搖勻，沸水浴20 min后迅速用冷水冷卻至室溫，然后加入間羥基聯苯40 μL，振蕩搖勻，靜置15 min，在525 nm處測吸光值，重復3次，計算樣品中的糖醛酸含量。

1.7 單糖組成測定

稱取1 mg多糖樣品于酸水解小瓶中，加入1 mL鹽酸-甲醇溶液，充氮氣密封后于80 ℃反應16 h，空氣泵吹干后加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸，在120 ℃下反應1 h，反復加入少量無水乙醇，水浴蒸發三氟乙酸。向蒸干后的樣品中加入PMP試劑0.5 mL和0.3 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 mL，振蕩搖勻，取0.1 mL于EP管中，在70 ℃下水浴反應30 min后加入超純水50 μL和0.3 mol/L鹽酸溶液50 μL，充分混勻后加入1 mL氯仿，萃取得到剩余的PMP試劑，棄去三氯甲烷層，保留水層，重復萃取3次，進行高效液相色譜檢測。

1.8 紫外全波長掃描分析多糖

將得到的兩種多糖樣品制成0.3 mg/mL的溶液，在200～900 nm范圍內進行紫外全掃描分析，測定多糖樣品的純度情況。

1.9 多糖紅外光譜分析

分別取兩種不同提取方法得到的豆渣可溶性多糖1 mg，加入180 mg光譜級溴化鉀，于瑪瑙研缽內研磨均勻，壓片至透明后，置于紅外光譜掃描儀在400～4000 cm-1范圍內進行掃描分析。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助提取法

利用超聲輔助熱水浸提豆渣中可溶性多糖，分別通過單因素和正交優化實驗考察超聲功率、浸提溫度、浸提時間和料液比4個因素對多糖得率的影響。

2.1.1 單因素實驗

由圖1可知，超聲輔助提取法的最佳單因素條件為超聲功率120 W，浸提時間4 h，浸提溫度60 ℃，料液比1∶20。超聲波可在介質中產生空化、振動、破碎等綜合效應，通過打破細胞壁從而成功提取出天然產物成分。在超聲過程中，超聲波使多糖分子振蕩而加速溶出，因此當超聲功率低于120 W時，多糖得率隨功率增加而增大。而功率過大時，雜質的溶出量持續增加，造成有效成分的比例降低，多糖得率下降[8]；溫度會加快分子的無規則運動，加快溶液的擴散速度，促進細胞內的多糖分子由內向外傳播，加速多糖分子的溶出。溫度低于60 ℃時，多糖得率隨溫度升高而增加，但當溫度超過60 ℃后，多糖得率下降，可能是由于高溫加速多糖分子解離，破壞其結構，導致多糖得率下降[9]；多糖本身具有一定的擴散性、滲透性和溶解性，當提取時間低于4 h時，隨著時間的增加，溶出的多糖增多，得率上升。但是當提取時間超過4 h后，因為多糖的擴散達到平衡，繼續浸提會導致蛋白質等成分溶出，降低多糖的比例，使得率出現下降趨勢；料液比高于1∶20時，多糖得率隨料液比降低而增加，此時豆渣浸沒不完全，有效成分不能充分溶出[10]。但當料液比低于1∶20時，多糖類物質的比例降低，多糖得率下降。

圖1 超聲功率、浸提溫度、浸提時間、料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power, extraction temperature, extraction time, solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

2.1.2 正交優化實驗

根據單因素實驗的結果，進行四因素三水平L9(34)的正交實驗，其因素及水平見表1，正交實驗設計及結果見表2。

表1 超聲輔助提取法正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal array design for ultrasonic-assisted extraction method

表2 超聲輔助提取法正交試驗結果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results for ultrasonic-assisted extraction method

由表2可知，影響多糖得率的各因素主次關系為：超聲功率(C)>料液比(D)>浸提時間(B)>浸提溫度(A)；且最佳工藝條件A3B1C3D2，即浸提溫度70 ℃、浸提時間3 h、超聲功率140 W、料液比1∶20，此條件下多糖得率為6.13%。

2.2 復合酶解提取法

利用纖維素酶與酸性蛋白酶以1∶1的比例復配進行酶解提取豆渣中可溶性多糖，分別通過單因素與正交優化實驗考察酶添加量、浸提溫度、浸提時間和料液比對多糖得率的影響。

2.2.1 單因素實驗

由圖2可知，復合酶解提取法的最佳單因素條件為浸提時間1.5 h，酶添加量2%，浸提溫度50 ℃，料液比1∶25。復合酶解提取法下的浸提時間和料液比對多糖得率的影響趨勢基本與超聲輔助提取法相同，但最佳浸提時間縮短至1.5 h，最佳料液比降低至1∶25；纖維素酶能夠破壞細胞的細胞壁，促進多糖在溶劑中擴散，提高多糖得率。當酶添加量低于2%時，多糖得率隨加酶量的增加而升高，這可能是由于酶添加量的增加使酶與底物接觸的機會增加，有利于多糖溶出[11]。但酶的添加量過高時，各組分會在細胞內出現相互抑制反應，導致多糖得率下降；溫度會加快分子的無規則運動，有助于多糖分子向細胞外擴散。溫度低于50 ℃時，多糖得率隨溫度升高而增加，在50 ℃時達到峰值，溫度超過50 ℃時得率下降，可能是因為酶的最適溫度為50 ℃，溫度過高會降低酶活，細胞壁分解不完全，降低了多糖溶出量，導致得率下降。

圖2 酶添加量、浸提溫度、浸提時間、料液比對多糖得率的影響Fig.2 Effects of enzyme additive amount, extraction temperature, extraction time and solid-to-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

2.2.2 正交優化實驗

根據單因素實驗的結果，進行四因素三水平L9(34)的正交實驗，其因素及水平見表3，正交實驗設計及結果見表4。

表3 復合酶解提取法正交實驗因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal array design for compound enzymatic extraction method

表4 復合酶解提取法正交試驗結果分析Table 4 Analysis of orthogonal test results of compound enzymatic extraction method

由表4可知，影響多糖得率的各因素主次關系為：酶添加量(D)>料液比(C)>浸提時間(A)>浸提溫度(B)；且最佳工藝條件A1B3C3D3，即復合酶添加量2.5%、浸提溫度60 ℃、浸提時間1 h、料液比1∶30，此條件下多糖得率為7.72%。

2.3 多糖形態特性對比

兩種提取方法得到的多糖研磨成粉末后的形態對比圖見圖3。

圖3 豆渣中可溶性多糖形態特性對比圖Fig.3 The comparison diagrams of morphological characteristics of soluble polysaccharides in soybean residues注：A為超聲輔助提取法得到的可溶性多糖；B為復合酶解提取法得到的可溶性多糖。

超聲輔助提取法得到的多糖粉末顆粒較小，質地細密。復合酶解提取法得到的多糖粉末顆粒較大，質地粗糙，且研磨更加困難。這可能是由于超聲的空化作用更有效地破壞了多糖的鏈式結構[12]，使多糖分子量變小，所以相比復合酶解提取法得到的多糖呈現出粉末顆粒較小、質地細密的特點。

2.4 多糖溶解量測定

由表5可知，超聲輔助提取法得到的豆渣中可溶性多糖的最大溶解量為5.1 mg/mL；復合酶解提取法的最大溶解量為4.2 mg/mL。超聲波使多糖分子的羥基暴露更充分，親水性更好，且超聲波的空化作用使提取出來的多糖分子相比復合酶解提取得到的多糖分子的粒徑更小，使得超聲輔助提取法得到的多糖具有更高的溶解性。

表5 豆渣中可溶性多糖溶解量Table 5 The dissolution amount of soluble polysaccharides in soybean residues

2.5 總糖含量與糖醛酸含量分析

以葡萄糖為標準品制作標準曲線，以葡萄糖的濃度為橫坐標，490 nm處的吸光值為縱坐標，得到的回歸方程為y=0.0102x+0.0243，R2=0.9979。將兩種多糖樣品在490 nm處的吸光值帶入標準曲線的線性回歸方程中，經計算得到超聲輔助提取法所得多糖總糖含量為83.28%，復合酶解提取法所得多糖的總糖含量為91.78%。

以半乳糖醛酸為標準品制作標準曲線，以半乳糖醛酸的濃度為橫坐標，525 nm處的吸光值為縱坐標，得到的回歸方程為y=0.014x+0.0217，R2=0.9952。將兩種多糖樣品在525 nm處的吸光值帶入標準曲線的線性回歸方程中，經計算得到超聲輔助提取法所得多糖的糖醛酸含量為4.34%，復合酶解提取法所得多糖的糖醛酸含量為7.02%。

經過化學組成分析發現，復合酶解提取法所得多糖的總糖含量與糖醛酸含量均高于超聲輔助提取法，多糖雜質少，酸性糖含量增加，可能是由于復合酶破壞了細胞壁，釋放出半乳糖醛酸。

2.6 單糖組成分析

進一步通過HPLC測定兩種不同提取方法所得多糖的單糖組成，以9種單糖標準品為對照，結果見表6。超聲輔助提取法所得多糖中的主要單糖組分間物質的摩爾比是Gal∶Ara∶Glc∶Man為10.2∶2.4∶60.9∶26.4；復合酶解提取法所得多糖中的主要單糖組分間物質的摩爾比是Gal∶Ara∶Glc∶Man∶GalA為11.1∶5.9∶56.3∶21.3∶5.3。通過分析單糖組成可知，兩種多糖的單糖組成基本一致，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，但酶解的糖中含有少量的半乳糖醛酸(GalA)，可能是由于復合酶的參與使細胞壁降解得更加徹底。

表6 兩種提取方法所得多糖的單糖組成Table 6 The monosaccharide composition of polysaccharides obtained by two extraction methods

2.7 紫外全波長掃描結果

超聲輔助提取法與復合酶解提取法所得多糖的紫外可見光譜檢測結果見圖4。

圖4 兩種提取方法所得多糖的UV-VIS吸收圖譜Fig.4 UV-VIS absorption spectra of polysaccharides obtained by two extraction methods

由圖4可知，兩種多糖在280 nm處顯示色氨酸特征吸收峰，表明兩種多糖中均有蛋白的存在，但280 nm處峰面積較小，說明蛋白含量極低，多糖純度較高[13]。

2.8 多糖紅外光譜分析

兩種提取方法得到的豆渣中可溶性多糖的紅外測定結果見圖5。

圖5 可溶性多糖的紅外譜圖Fig.5 The infrared spectra of soluble polysaccharides

兩種多糖在3404，2926，1653，1409，1152，1016 cm-1附近處有較強的吸收峰。其中在3404 cm-1附近處出現的吸收峰峰形較寬，為多糖-OH的伸縮振動。在2926 cm-1附近處的吸收峰為多糖的C-H伸縮振動。在1653 cm-1附近處的吸收峰為多糖的羰基O-C-O非對稱振動。在1409 cm-1附近處的吸收峰由半乳聚糖骨架上的C-H振動產生。在1152 cm-1附近處的吸收峰由半乳糖共振產生，而在1016 cm-1附近處的吸收峰則表明該種多糖是吡喃型多糖。通過對以上官能團數據分析可知，超聲輔助提取法和復合酶解提取法得到的多糖均具有多糖類物質的一般特征吸收峰[14-15]，且對比兩種多糖的紅外譜圖發現，兩種提取方法均未破壞或者改變多糖的特征官能團，因此推斷多糖的活性沒有被改變。

2.9 兩種提取方法總結比較

由表7可知，復合酶解提取法相比超聲輔助提取法提取時間更短，提取溫度低，用較少的豆渣且只需要添加少量的酶，便可以提高豆渣中可溶性多糖的得率。而超聲輔助提取法得到的豆渣中可溶性多糖比復合酶解提取法的溶解性好，粉末顆粒較小，質地細密。

表7 兩種提取方法的最佳提取工藝和結果比較Table 7 The comparison of the optimal extraction technology and results of the two extraction methods

3 結論

超聲輔助提取法影響豆渣中的水溶性大豆多糖得率的最主要因素是超聲功率，且最佳工藝條件為超聲功率140 W、浸提溫度70 ℃、浸提時間3 h、料液比1∶20，此條件下豆渣中可溶性多糖得率為6.13%。復合酶解提取法的最主要因素是酶添加量，且最佳工藝條件為酶添加量2.5%、浸提溫度60 ℃、浸提時間1 h、料液比1∶30，此條件下豆渣中可溶性多糖得率為7.72%。

以上兩種提取方法相比傳統的熱水浸提法，都具有快速、高效、節省能源、避免浪費等特點。且由紅外分析可知，兩種提取方法均未改變多糖的特征官能團，對多糖活性沒有影響。雖然超聲輔助提取法相比復合酶解提取法得到的多糖粉末質地更細密，溶解性更好，但考慮到實際應用時應該滿足易操作、節能、省時和降低成本的特點，所以復合酶解提取法更易在生產中實現。為了增強豆渣中可溶性多糖的利用效果，未來可以考慮在復合酶解提取法的基礎上加以超聲輔助，提高多糖溶解性，以此促進豆渣的綜合利用和大豆工業的發展，這也將是我們接下來進一步探討的方向。