不同發酵方式蘿卜泡菜中有機酸的變化分析

王芮東，李楠，衛博慧，杜文紅

(1.運城學院 理科實驗中心，山西 運城 044000；2.運城學院 生命科學系，山西 運城 044000)

蘿卜泡菜是以蘿卜為原料，添加一定濃度的食鹽溶液，通過乳酸發酵而成的一種發酵食品，具有酸脆爽口、風味獨特的特點[1-3]，富含膳食纖維、維生素、氨基酸及多種有機酸[4-6]，而有機酸是蘿卜泡菜中一種主要呈味物質，其含量的多少與泡菜的發酵程度有直接關系[7-9]。

目前，高效液相色譜法(HPLC)用于泡菜中有機酸的檢測研究較少，李志華[10]采用HPLC同時測定泡芥菜、小尖椒、豆角液汁中草酸、酒石酸、乳酸等5種有機酸；葉陵等[11]采用自然、純菌種兩種方式發酵剁辣椒，并對其有機酸的含量進行比較分析。

本試驗建立了HPLC法同時測定蘿卜泡菜中7種有機酸含量的方法，對采用自然、老泡菜水和乳酸菌制劑3種發酵方式制作的蘿卜泡菜在第0～10 d發酵過程中有機酸的變化進行了研究，比較采用不同發酵形式制作的泡菜在發酵過程中各有機酸的變化差異，有助于對泡菜的品質進行科學調控，為泡菜的深入研究提供了有效的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蘿卜、白砂糖、精鹽、各種調料：均購自運城市沃爾瑪超市。

磷酸二氫鉀、磷酸(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；乳酸、檸檬酸、草酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、甲醇(色譜純)：上海恒遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；PHS-3C酸度計 上海佑科儀器有限公司；S-1-150S高速離心機 鞏義市宏華儀器有限公司；KQ-2200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制備

1.3.1.1 基本配方

蘿卜500 g、水1000 mL、糖50 g、食鹽60 g、花椒20 g、干辣椒10 g、大蒜20 g、姜50 g、八角8 g。

1.3.1.2 工藝流程

1.3.1.3 操作要點

原料選擇及處理：挑選新鮮、無損害的蘿卜，洗凈、晾干后，均勻切分成1 cm×1 cm×5 cm大小的蘿卜塊。

鹵水配制：按配方比例在水中加入糖、食鹽等輔料，煮沸后冷卻備用。

裝壇：把蘿卜與鹵水一同加入泡菜壇中，加水密封。

1.3.1.4 發酵方式

自然發酵：按蘿卜與鹵水質量比(下同)為1∶2裝壇，密封后發酵。

乳酸菌制劑發酵：按蘿卜與鹵水為1∶2的比例裝壇，并按泡菜總質量的0.3%加入乳酸菌制劑。

老泡菜水發酵：按蘿卜∶鹵水為10∶19的比例裝壇，并加入總質量3.5%的老泡菜水。

1.3.2 有機酸測定方法的建立

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)；檢測器：VWD檢測器；檢測波長：210 nm；流動相：0.01 mol/L磷酸二氫鉀∶甲醇為98∶2(磷酸調pH至2.5)；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2.2 有機酸標準溶液制備及標準曲線繪制

稱取草酸10 mg、酒石酸40 mg，乳酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸各150 mg，琥珀酸350 mg，用流動相溶解并定容至25 mL容量瓶中，得到0.4 mg/mL草酸，1.6 mg/mL酒石酸，6 mg/mL蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸，14 mg/mL琥珀酸的有機酸混合標準母液，用流動相稀釋0，2，5，10，25，50倍經0.45 μm濾膜過濾后進樣，以峰面積對質量濃度繪制標準曲線。

1.3.3 樣品的預處理

按發酵蘿卜∶汁液為1∶1制取勻漿，稱取勻漿5 g加10 mL超純水，超聲處理20 min后9000 r/min離心15 min，上清液經0.45 μm濾膜過濾后上機檢測[12-13]。

1.4 數據分析

采用SPSS 19.0、Excel 2007軟件進行數據處理和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

由表1可知，7種酸的相關系數均大于0.9971，表明7種有機酸的峰面積與質量濃度的線性關系很好，該條件下可進行泡菜中有機酸的檢測。

表1 有機酸標準曲線的線性參數Table 1 The linear parameters of the standard curves of organic acids

2.2 精密度

將稀釋10倍的混標連續進樣6次，計算其精密度為0.38%～1.67%，表明該法精密度較好，結果見表2。

表2 測定方法的精密度Table 2 The precision of testing methods

2.3 重復性

精密稱取乳酸菌制劑發酵泡菜第6天的樣品 6 份，按上述色譜條件上機分析，計算其相對標準偏差，其結果為0.53%～7.38%，說明該方法重現性好，結果見表3。

2.4 加標回收率

準確稱取乳酸菌制劑發酵第10天的樣品6份，將有機酸標準混合液分高、中、低3個梯度(120%、100%、80%)加入樣品待測液中，預處理后進行色譜分析，分別計算其加標回收率，加標回收率為92.8%～106.4%，說明該法精確度高，結果見表4。

表4 有機酸加標回收率Table 4 The recovery rates of organic acids

2.5 泡菜中有機酸的分析

2.5.1 HPLC圖譜分析

有機酸混合標樣及自然、乳酸菌制劑、老泡菜水3種發酵方式第4天泡菜的HPLC圖見圖 1。

圖1 有機酸混合標樣(A)及自然(B)、乳酸菌制劑(C)和老泡菜水(D)發酵第4天泡菜的高效液相色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of pickles by organic acid mixed standard sample (A), natural (B), lactic acid bacteria preparation (C) and old pickle water (D) fermentation methods on the 4th day注：1為草酸；2為酒石酸；3為D-蘋果酸；4為乳酸；5為乙酸；6為L-蘋果酸；7為檸檬酸；8為琥珀酸。

由圖1可知，有機酸標準品、泡菜樣品中的各有機酸均能很好分離。

2.5.2 泡菜中7種有機酸的分析結果

3種發酵方式第0～10 d的泡菜樣品中7種有機酸含量見表5。

表5 3種發酵方式下蘿卜泡菜第0～10 d的有機酸含量Table 5 The organic acid content of pickled radish by three fermentation methods at the 0～10th day mg/mL

由表5可知，草酸含量在自然、乳酸菌制劑、老泡菜水3種發酵方式中均呈降低趨勢，且在第0～6 d顯著下降(p<0.05)，第6天后下降速度趨于平緩，發酵至第10天時分別降至(104.726±0.006)，(108.372±0.023)，(101.187±0.006) mg/mL，均遠遠低于第0天的(306.815±0.055)，(312.533±0.041)，(287.544±0.111) mg/mL，這是由于蘿卜本身含有一定量草酸，發酵過程中會與醇類生成酯類物質[14]。

酒石酸含量在3種發酵方式中均呈先下降后上升趨勢，在第0～8 d呈明顯下降趨勢(p<0.05)，分別由最高值(1.898±0.046)，(1.817±0.077)，(1.825±0.025) mg/mL下降至最低值(0.411±0.004)，(1.003±0.109)，(0.372±0.307) mg/mL后呈顯著上升趨勢(p<0.05)，且乳酸菌制劑發酵方式的下降幅度明顯低于其他兩種方式。

檸檬酸含量在自然、乳酸菌制劑發酵方式中呈先下降后上升趨勢，第0～4 d分別由(0.611±0.058)，(0.522±0.042) mg/mL降至最低值(0.123±0.026)，(0.127±0.003) mg/mL之后又上升至第10天的最高值(0.689±0.036)，(0.574±0.028) mg/mL，而在老泡菜水發酵中，發酵至第2天后均未檢出，這可能與老泡菜水中微生物的代謝有一定關系。

乳酸、乙酸含量在3種發酵方式中均呈上升趨勢，乳酸上升速度均高于乙酸。發酵至第10天，乳酸菌制劑發酵中的乳酸含量顯著高于其他兩種發酵(p<0.05)，分別為(10.147±0.011)，(8.283±0.025)，(5.384±0.285) mg/mL，這是由于乳酸菌制劑發酵中乳酸菌數量較多，通過乳酸菌的生長繁殖會產生更多的乳酸[15]；在第0～10 d的發酵過程中，乳酸菌制劑發酵中的乙酸含量均高于其他兩種方式，這是由于乳酸菌制劑發酵中醋酸菌數量多于其他兩種方式，通過醋酸發酵會產生較多的醋酸；在乳酸菌制劑發酵中的乳酸含量上升速度明顯高于其他兩種方式。

琥珀酸含量在3種發酵方式中均呈前期上升后期下降的趨勢，自然、乳酸菌發酵方式的變化趨勢基本相似，發酵至第4天上升至最高值，分別為(0.727±0.053)，(0.690±0.013) mg/mL，之后又呈下降趨勢，而老泡菜水發酵方式發酵至第2天上升至最高值(0.529±0.025) mg/mL后趨于下降，第8天后未檢出。

DL-蘋果酸含量在3種發酵方式中均呈現波動式的變化趨勢，由第0天的(1.582±0.015)，(1.183±0.014)，(1.527±0.026) mg/mL下降至第10天的(1.269±0.025)，(1.159±0.056)，(1.196±0.061) mg/mL。

草酸、乙酸含量在乳酸菌制劑發酵中均顯著高于其他兩種方式(p<0.05)。

2.5.3 泡菜中有機酸總量的分析

3種發酵方式下蘿卜泡菜在第0～10 d的有機酸總量變化見圖2。

圖2 3種發酵方式下泡菜中有機酸總量的變化Fig.2 The changes in total amount of organic acids in pickles by three fermentation methods

由圖2可知，隨著發酵的進行，自然、乳酸菌制劑、老泡菜水3種發酵方式有機酸總量均呈下降趨勢，分別由第0天的(312.044±0.077)，(316.807±0.070)，(292.193±0.063) mg/mL下降至第10天的(117.665±0.068)，(122.773±0.061)，(108.951±0.143) mg/mL，并且第0～4 d下降趨勢明顯，第4～6 d下降趨勢平緩；發酵過程中，乳酸菌制劑發酵的有機酸總量始終高于其他兩種方式。

3 結論

本試驗采用高效液相色譜法對自然、老泡菜水和乳酸菌制劑3種發酵方式制作的蘿卜泡菜在第0～10 d的7種有機酸進行定性定量分析，得出以下結論：

3種發酵方式中，草酸含量均呈下降趨勢，第0～6 d下降變化顯著，第6天后下降速度趨于平緩；乳酸、乙酸含量均呈上升趨勢，乳酸含量上升速度明顯高于乙酸，乳酸菌制劑發酵中乳酸含量的上升速度明顯高于其他兩種方式，乙酸含量在乳酸菌制劑發酵方式中均高于其他兩種方式；酒石酸含量均呈先下降后上升趨勢，在第0～8 d下降趨勢顯著，并且乳酸菌制劑發酵的下降幅度明顯低于其他兩種方式，第8天后上升趨勢顯著；琥珀酸含量均呈先上升后下降趨勢，自然乳酸菌發酵方式在第4天上升至最高值后開始下降，而老泡菜水發酵方式在第2天上升至最高值后下降，第8天后未檢出；檸檬酸含量在自然、乳酸菌制劑發酵方式中呈先下降后上升趨勢，而在老泡菜水發酵中，發酵至第2天以后均未檢出；DL-蘋果酸含量在3種發酵方式中均呈波動式的變化趨勢。

7種有機酸總量在3種發酵方式中均呈下降趨勢，且第0～4 d下降趨勢明顯，第4～6 d下降趨勢平緩，在整個發酵過程中，乳酸菌制劑發酵方式始終高于自然和老泡菜水的發酵方式。