當歸紅芪超濾物對放射性H9C2細胞損傷 TNF-α/CTRP9信號通路相關因子表達的影響

孔姍姍，汪鳴，蔣虎剛，王新強，王艷平，邱璐，邱勇玉，趙信科

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

放射性心臟病（radiation-induced heart disease，RIHD）是目前已知的胸部惡性腫瘤放療后死亡的主要非惡性原因之一，并且與其高發病率和死亡率相關[1-2]。目前，臨床針對RIHD尚無確切的治療方法，可用于對癥治療的藥物鹽酸貝那普利由于有頭暈頭痛、干咳、心慌、全身疲乏等不良反應而不能被廣泛使用[3]。因此，深入研究RIHD的發病機制，尋找安全、有效防治RIHD的藥物，提高正常心臟的耐受劑量是胸部惡性腫瘤放射治療亟需解決的重要問題。國外研究發現，電離輻射可激活TNF-α信號通路，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可結合心肌細胞膜表面特異性受體直接參與多種心肌損傷[4-5]，可能是RIHD的潛在發病機制之一。TNF-α作為腫瘤壞死因子相關蛋白9（CTRP9）的上游信號分子，在心肌損傷過程中可調控CTRP9的表達[6]。本課題組前期研究發現，當歸紅芪超濾物可通過抑制細胞凋亡、氧化應激、心肌纖維化等途徑防治放射性心肌損傷[7]，但其防治RIHD的具體機制尚未完全明確。因此，本實驗以放射性H9C2細胞損傷為模型，基于TNF-α/CTRP9信號通路研究當歸紅芪超濾物抗輻射致心肌損傷的作用及潛在機制，為當歸紅芪超濾物防治RIHD提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

SPF級成年SD大鼠30只，體質量（200±20）g，甘肅中醫藥大學科研實驗中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2018-049。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級實驗室，溫度（23±2）℃，相對濕度45%～55%，12 h光暗周期循環，常規標準飼料喂養。H9C2細胞購于美國模式菌種保藏中心，編號CRL-1446。

1.2 藥物

當歸紅芪超濾物，本課題組前期分離所得，批號20190619；鹽酸貝那普利片，深圳信立泰藥業股份有限公司，5 mg/片，批號20181114。

1.3 主要試劑與儀器

肌鈣蛋白T（cTnT）、肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）及C-反應蛋白（CRP）ELISA試劑盒，杭州聯科生物技術股份有限公司，批號分別為39560978、56430821、60732801；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及RT-PCR試劑盒，日本TAKARA公司，批號DRR053A；蛋白提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0020；TNF-α和CTRP9抗體，美國Immunoway公司，貨號分別為YM3906、YM6867；轉化生長因子-β（TGF-β）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體，美國Immunoway公司，貨號分別為YM6305、YM3365。超凈工作臺、Eppendorf移液槍、酶標儀（美國Thermo公司），Titan電鏡（日本奧林巴斯），PE2400型PCR擴增儀（美國PE公司），高速低溫離心機（美國Sigma公司），精密電子天平（OHAUS公司），CO2細胞培養箱（日本三洋，型號CabinetX-raysystem），激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯，OLYMPUSIX81），X-ray機（美國Faxitron公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

依據本課題組前期研究結果，同時參考相關文獻輻射劑量[8-9]，6 Gy為建立RIHD細胞模型的最佳輻射劑量。因此，本研究采用6 Gy輻射劑量X線照射制備RIHD模型。

2.2 藥物血清制備

將30只實驗大鼠按隨機數字表分為鹽酸貝那普利組、當歸紅芪超濾物組、鹽酸貝那普利＋當歸紅芪超濾物組，每組10只。給藥前所有大鼠禁食8 h，灌胃給藥，連續5 d，每日2次，每日給藥量分別為鹽酸貝那普利0.9 mg/kg、當歸紅芪超濾物0.5 g/kg、鹽酸貝那普利0.9 mg/kg＋當歸紅芪超濾物0.5 g/kg。大鼠第5日給藥后90 min，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離收集血清，置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 分組及干預

將H9C2細胞隨機分為空白組（不干預）、陰性對照組（0 Gy X線照射并予生理鹽水干預）、模型組（6 Gy X線照射并予生理鹽水干預）、鹽酸貝那普利組（6 Gy X線照射并予鹽酸貝那普利藥物血清干預）、當歸紅芪超濾物組（6 Gy X線照射并予當歸紅芪超濾物藥物血清干預）、鹽酸貝那普利＋當歸紅芪超濾物組（聯合組，6 Gy X線照射并予鹽酸貝那普利藥物血清＋當歸紅芪超濾物藥物血清干預）。均為單次給藥，給藥體積為0.5 mL，給藥時間為成模后，檢測時間為干預后48 h。

2.4 H9C2細胞培養

超凈工作臺紫外燈照射30 min，取新鮮培養基和血清，37 ℃水浴加熱，75%酒精擦拭并移至無菌操作臺；取-150 ℃凍存的H9C2細胞，將其迅速置于37 ℃水浴中快速解凍，1000 r/min離心5 min，再用75%酒精擦拭，移至無菌操作臺；棄上清，加入新鮮培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養，次日觀察并更換培養基，2～3 d傳代1次。

2.5 ELISA檢測肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白Ⅰ及C-反應蛋白含量

于96孔酶標板內嚴格按照cTnT、cTnⅠ及CRP ELISA試劑盒說明書進行操作。加入待測樣品10 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌5次；滴加酶標抗體50 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌5次；每孔加顯色液A 50 μL，再加顯色液B 50 μL，37 ℃避光顯色10 min，最后加入終止反應液50 μL；于酶標儀450 nm波長處測量各孔OD值，計算標準曲線的回歸方程，求得樣品濃度。

2.6 RT-PCR檢測腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子相關蛋白9 mRNA的表達

根據RNA試劑盒說明書提取心肌細胞總RNA，配制反轉錄體系；反轉錄程序：25 ℃、5 min，42 ℃、60 min，70 ℃、10 min，4 ℃保存。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子相關蛋白9的表達

取細胞中蛋白，BCA試劑盒對蛋白進行定量，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電轉膜1 h至PVDF膜，37 ℃、5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育TNF-α、CTRP9、GAPDH（均1 1000∶ ）一抗過夜，次日加入二抗（1∶ 1 0 000），37 ℃孵育1 h。ECL顯影，Quantity One軟件對蛋白灰度值進行分析。

2.8 免疫熒光檢測轉化生長因子-β和α-平滑肌肌動蛋白的表達

取對數生長期H9C2細胞，以1.5×105個細胞/孔置于6孔板進行細胞爬片，待細胞貼壁后，PBS洗滌；4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次×5 min；0.25%Triton X-100進行透膜，2%牛血清白蛋白（1×TBST溶液配制）封閉30 min，4 ℃孵育稀釋的一抗（1 200∶ ）過夜；加稀釋的熒光二抗工作液（1 500∶ ）室溫避光孵育2 h，PBS洗3次×5 min，DAPI室溫孵育15 min，PBS洗3次×5 min，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照分析。

3 統計學方法

采用SPSS24.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 ELISA檢測結果

與空白組比較，陰性對照組H9C2細胞cTnT、cTnⅠ及CRP含量無明顯變化（P＞0.05），模型組H9C2細胞cTnT、cTnⅠ及CRP含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸貝那普利組、當歸紅芪超濾物組和聯合組H9C2細胞cTnT、cTnⅠ及CRP含量明顯減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組H9C2細胞cTnT、cTnⅠ及CRP表達比較（±s）

表2 各組H9C2細胞cTnT、cTnⅠ及CRP表達比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n cTnT/（ng/L） cTn /Ⅰ（ng/L） CRP/（μmol/L）空白組 6 10.97± 1.86 7.51±3.05 2.67±0.73 陰性對照組 6 11.56± 2.17 6.08±2.31 3.92±0.80 模型組 6 89.23±14.79## 28.17±8.79## 35.98±4.37## 鹽酸貝那普利組 6 34.28± 8.02* 13.06±3.11* 15.35±2.53* 當歸紅芪超濾物組 6 39.43±10.29* 15.84±3.75* 18.21±3.82* 聯合組 6 26.76± 9.69* 10.04±2.52* 10.97±2.16*

4.2 RT-PCR檢測結果

與空白組比較，陰性對照組H9C2細胞TNF-α和CTRP9基因表達無明顯變化（P＞0.05），模型組H9C2細胞TNF-α和CTRP9基因表達顯著上調（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸貝那普利組、當歸紅芪超濾物組、聯合組H9C2細胞TNF-α和CTRP9基因表達明顯下調（P＜0.05）。見表3。

表3 各組H9C2細胞TNF-α和CTRP9 mRNA表達比較（±s）

表3 各組H9C2細胞TNF-α和CTRP9 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n TNF-α CTRP9 空白組 6 1.08±0.19 1.63±0.26 陰性對照組 6 1.13±0.12 1.59±0.22 模型組 6 2.25±0.30## 2.47±0.54## 鹽酸貝那普利組 6 1.39±0.27* 1.43±0.22* 當歸紅芪超濾物組 6 1.44±0.18* 1.78±0.27* 聯合組 6 1.16±0.21* 1.09±0.38*

4.3 Western blot檢測結果

與空白組比較，陰性對照組H9C2細胞TNF-α和CTRP9蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），模型組H9C2細胞TNF-α和CTRP9蛋白表達明顯上調（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸貝那普利組、當歸紅芪超濾物組、聯合組H9C2細胞TNF-α和CTRP9蛋白表達明顯下調（P＜0.05）。見圖1、表4。

圖1 各組H9C2細胞TNF-α和CTRP9蛋白免疫印跡圖

表4 各組H9C2細胞TNF-α和CTRP9蛋白表達比較（±s）

表4 各組H9C2細胞TNF-α和CTRP9蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n TNF-α CTRP9 空白組 6 0.37±0.09 0.24±0.07 陰性對照組 6 0.38±0.10 0.26±0.09 模型組 6 0.89±0.15## 0.67±0.12## 鹽酸貝那普利組 6 0.45±0.09* 0.42±0.06* 當歸紅芪超濾物組 6 0.41±0.08* 0.25±0.06* 聯合組 6 0.36±0.05* 0.28±0.07*

4.4 免疫熒光檢測結果

模型組H9C2細胞α-SMA和TGF-β表達較空白組、陰性對照組顯著上調；鹽酸貝那普利組、當歸紅芪超濾物組、聯合組α-SMA和TGF-β表達較模型組顯著下調。見圖2。

圖2 各組H9C2細胞α-SMA和TGF-β蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×400）

5 討論

中醫學認為，放射性心肌損傷屬外感火熱邪毒，損傷心氣、心血的致病范疇。依據其臨床表現心悸、胸悶、胸痛、心律失常及心力衰竭等癥狀，可歸屬中醫學“心悸”等范疇；其病位在心，主要致病因素為外感火熱邪毒，從外侵襲人體，直中臟腑；具有火熱之性，易耗津傷液，致氣血兩虛，心失所養，發為心悸[10]。又《素問?至真要大論篇》有“諸躁狂越，皆屬于火”，因此，中醫學認為射線是熱毒之邪，照射心臟時引起熱積血瘀，氣陰兩傷，久病入絡，氣血凝滯，導致纖維化發生，通過補益心氣、養血活血等治法，可調整心臟功能[10-11]。當歸紅芪超濾物源自《內外傷辨惑論》當歸補血湯，由黃芪和當歸按5 1∶ 比例配制而成，具有補氣生血、甘溫除熱功效，主治血虛發熱等。

RIHD為心臟受放射性損傷后的遲發應激反應，其主要病理改變為心臟組織彌漫性間質纖維化和膠原沉積，以及由于心肌成纖維細胞積累和內膜增生導致的動脈和小動脈腔狹窄，進而出現一系列心血管并發癥[12]。研究表明，X線照射后大鼠心肌組織TNF-α表達明顯升高[13]，且TNF-α促進心肌纖維化的進展[14]。α-SMA和TGF-β1作為心肌成纖維細胞觀察指標，可通過刺激心肌成纖維細胞活化，導致活化的心肌成纖維細胞分泌膠原，從而參與心肌纖維化過程[15]。近年有關TNF-α/CTRP9信號通路在心血管系統的研究日益增多。研究表明，CTRP9在血漿中水平極低，其在大鼠心臟組織中高表達，提示心臟局部產生的CTRP9可能參與心臟正常生理功能調控，同時參與心血管疾病的病理生理過程[16]；CTRP9可通過AMPK依賴機制和抑制NADPH氧化酶的表達[17]，發揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用[18-19]。

本研究發現，輻射及給藥后，與空白組比較，陰性對照組cTnT、cTnⅠ及CRP含量無明顯變化，模型組cTnT、cTnⅠ及CRP含量均顯著增加，提示輻射可導致明顯心肌細胞損傷；Western blot和RT-PCR結果顯示，模型組TNF-α和CTRP9蛋白及基因表達較空白組、陰性對照組上調，提示TNF-α/CTRP9通路激活，參與了輻射損傷過程；各給藥組H9C2細胞TNF-α和CTRP9蛋白及基因表達較模型組下調，提示鹽酸貝那普利、當歸紅芪超濾物通過抑制TNF-α/CTRP9通路激活，參與了輻射損傷后修復；免疫熒光結果顯示，與空白組比較，模型組α-SMA和TGF-β表達上調，鹽酸貝那普利組、當歸紅芪超濾物組、聯合組α-SMA和TGF-β表達下調，提示當歸紅芪超濾物、鹽酸貝那普利可通過抑制α-SMA和TGF-β表達，減輕心肌損傷及心肌纖維化的發生。

綜上，當歸紅芪超濾物、鹽酸貝那普利可通過調控TNF-α/CTRP9信號通路減輕放射性心肌損傷后心肌纖維化的發生，發揮心肌保護作用。本研究揭示了當歸紅芪超濾物抗輻射致心肌損傷的作用及潛在機制，可為當歸紅芪超濾物防治RIHD提供依據。