天津臨港濱海濕地公園水體細菌種群特征

馬香菊，徐慧韜，王麗平

國家環境保護河口與海岸帶環境重點實驗室，中國環境科學研究院

人工濕地是利用基質、植物及微生物的協同作用對水體污染物進行凈化處理且兼具美化環境功能的生態凈化技術[1-3]，填料基質可沉淀、過濾污染物，并為微生物和植物生長提供場所；植物通過吸收、吸附、過濾等作用去除有機物，同時為微生物繁殖提供附著面積；微生物(主要指細菌)則以污染物為營養物質進行吸收轉化從而實現污染物的降解，微生物作用對于系統中氮去除的占比高達45%，是人工濕地氮去除的主要作用者[4]。另外，人工濕地植物發達的根系不但為微生物的附著、棲息、繁殖提供了場所，還能通過分泌有機物促進微生物的新陳代謝作用，使植物根系具有豐富的細菌多樣性。研究表明，植物根系細菌種群在多環芳烴(PAHs)、重金屬等污染物的降解過程中發揮著重要的作用[5-7]，根系細菌總數與生化需氧量(BOD5)的去除具有顯著相關性，其中硝化和反硝化菌的數量與氨氮的去除具有極顯著正相關性[8-9]。因此，細菌種群特征的研究結果可以在一定程度上反映濕地系統對污染物的去除能力。

傳統的培養分離技術只適用于環境中的可培養微生物[10]，具有極大的局限性；而分子生物學技術是調查環境微生物種群結構的有效工具，能夠進一步揭示自然界中不可培養微生物的種群組成特征[11-12]。高通量測序技術(high-throughput sequencing)被稱為第二代測序技術，測序速度快、成本低、數據全面，不僅能檢測各種已知的微生物，還能發現新物種[13-15]，是水體和濕地微生物研究的重要測序手段。姚美辰等[16]利用高通量測序技術研究了遼河保護區不同類型人工濕地底泥和蘆葦根際微生物的菌群結構；Medinger等[17]將高通量測序技術應用于貧營養湖泊濕地中的囊泡蟲類分析，發現該技術在群落結構分析中具有優勢；Arfi等[18]對紅樹林濕地真菌進行高通量測序，發現優勢菌種為子囊菌，進一步證實了該技術在生物種群多樣性分析中的實用性；王紹祥等[3]提出高通量測序技術應用于水域微生物種群結構研究時，可根據特殊整體與普遍整體的相關性，分析結構變化可能會引起的環境問題。

筆者將高通量測序技術應用于天津臨港濱海濕地公園水體細菌種群結構的研究，選取夏秋兩季對細菌種群特征及其與氮、磷營養鹽等環境因子之間的響應關系進行分析和比較，旨在了解能適應濱海地區高鹽堿環境且與氮、磷降解具有較強相關性的優勢細菌種類，以期為開展天津臨港濱海人工濕地細菌種群降解污染物的機理研究提供基礎數據，同時為人為調控濕地系統實現高效凈化效果提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與樣品采集

天津臨港濱海濕地公園建于2012年，是一座以水質凈化為主兼具景觀效果的人工濕地處理系統，其位于天津濱海新區海河入海口南側灘涂淺海區，占地面積約63萬m2，其中水體面積約17萬m2，濕地公園進水為工業園區污水處理廠尾水和園區雨水，設計處理規模為17 500 m3/d，濕地公園內植物配置由蘆葦、香蒲、水蔥、菖蒲、千屈菜、黃花鳶尾組成，其中蘆葦和香蒲為種植面積最大的2種植物。

進入濕地公園的水依次經過調節塘、人工濕地、景觀水體，分別在濕地進水口(W1)、潛流濕地區(W2)、景觀水體區(W3與W4)和濕地出水口(W5)設置采樣點(圖1)，于2018年8月(夏季)和10月(秋季)在每個采樣點采集水樣1 000 mL(每個點采集3個平行樣)，于4 ℃保存并盡快運回實驗室。W1、W5采樣點采集表層水樣，其他采樣點采集蘆葦根系區上覆水樣。

圖1 采樣點設置Fig.1 Setting of sampling sites

1.2 研究方法

1.2.1水樣理化性質分析

1.2.2水樣基因組DNA提取

選用0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾500 mL水樣，提取濾膜細菌DNA，試驗操作嚴格遵守PowerWater?DNA Isolation Kit試劑盒的操作說明，利用1%的瓊脂凝膠電泳檢查DNA的純度和濃度。

1.2.3PCR擴增及測序

以稀釋后的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，采用引物為338F：5′—ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG—3′和806R：5′—GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT—3′，并用高效和高保真酶進行PCR擴增，確保擴增效率和準確性，擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，純化后的DNA采用Illumina MiSeq平臺進行雙端(Paired-end)測序，采用滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列逐一作質量篩查，從而獲得每個樣本的有效序列。

1.3 數據分析

MiSeq測序得到的PE reads首先根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，通過I-Sanger生物信息分析云平臺對測序得到的序列進行優化，得到OTU(分類單元)代表序列，在此基礎上進行Alpha多樣性分析，計算Sobs、Chao和Shannon等細菌物種數、種群豐富度與多樣性指數，并在OTU水平下繪制物種Venn圖；同時統計不同分類水平下各樣本的細菌種群組成，評估各樣本的Beta多樣性，繪制相關性Heatmap圖并進行主成分(PCA)分析，研究細菌種群分布與環境因子間的相關關系。

2 結果與討論

2.1 水體理化性質

表1 不同季節各采樣點水樣理化性質Table 1 Physical and chemical properties of water samples at each sampling site in different seasons

2.2 細菌多樣性和豐富度

DNA基因組序列分析結果顯示，夏季各采樣點的細菌基因有效序列長度為225～497 bp，有效序列數為40 249～70 931；秋季各采樣點的細菌基因有效序列長度為268～479 bp，有效序列數為26 092～31 685。統計各樣本序列數及其對應的OTU計算各采樣點的Alpha多樣性，結果見表2，反映樣本OTU覆蓋情況的覆蓋率均高于0.99，表明測序的數據量合適，基本能代表樣本的真實情況。

由表2可見，代表樣本物種多樣性的Shannon指數，夏季為4.25～5.14，各采樣點表現為W5>W3>W2>W4>W1；秋季為3.07～4.32，各采樣點表現為W5>W3>W1>W4>W2，夏季各采樣點細菌多樣性均高于秋季。代表樣本種群豐富度的Chao指數，夏季為569.10～894.04，各采樣點表現為W2>W5>W3>W4>W1；秋季為473.22～995.81，各采樣點表現為W1>W3>W4>W5>W2。表征實際觀測到的物種數的Sobs指數，夏季為446～757，各采樣點表現為W2>W3>W5>W4>W1；秋季為361～678，各采樣點表現為W1>W3>W5>W4>W2，除了W1采樣點外，其他采樣點均為夏季高于秋季。

表2 不同季節各采樣點細菌的Alpha多樣性Table 2 Alpha diversity of bacteria at each sampling site in different seasons

夏季濕地公園水體細菌多樣性高于秋季，夏季細菌種群較多，但Chao指數顯示，W1與W4采樣點夏季種群豐富度低于秋季，表明夏、秋兩季水體細菌種群結構存在明顯差異。夏季各采樣點中，W2采樣點具有較高的細菌多樣性、最高的種群豐富度和物種數，W1采樣點具有最低的細菌多樣性、種群豐富度和物種數；秋季各采樣點的細菌多樣性與種群豐富度分布特征與夏季明顯不同，W1采樣點具有較高的細菌多樣性，最高的種群豐富度和物種數，W2采樣點具有最低的細菌多樣性、種群豐富度及物種數。濕地公園內水體自W1采樣點向W5采樣點方向流動，在水體自凈和水體微生物對營養物質的吸收轉化作用下，水體營養物質濃度沿水流方向逐漸遞減[20]，營養物質對微生物生長的影響體現為營養物質濃度越高，微生物種群多樣性及豐富度越高[21]；另一方面，植物也會影響根系微生物的種群多樣性和豐富度，植物根系為微生物繁殖提供附著表面積，其分泌的碳水化合物、羧酸和氨基酸等有機化合物也易于被微生物利用，從而保障微生物的生長代謝過程[6,22]。而不同植物根系以及同種植物根系不同深度的細菌種群特征具有差異性[23-25]，有研究[21,26]表明，蘆葦根系細菌種群多樣性和豐富度均高于香蒲、美人蕉等其他人工濕地常見植物。因此在生長旺盛的夏季，蘆葦發達的根系及大量的根系分泌物為微生物生長創造了良好的條件，使得夏季潛流濕地區(W2采樣點)表現出極具顯著性優勢的細菌種群多樣性和豐富度特征；而秋季蘆葦逐漸進入休眠期，相比于夏季，根系分泌物對微生物生長的影響作用減弱，營養物質成為微生物種群多樣性和豐富度的主要影響因素，因此具有最高營養水平的濕地進水口(W1采樣點)表現出極具顯著性優勢的細菌種群多樣性和豐富度特征。

2.3 細菌種群組成

2.3.1夏季細菌種群組成

對夏季樣本OTU進行物種分類統計，共得到細菌34門、423屬、641種。夏季門和屬分類水平下各采樣點的細菌優勢種組成如圖2所示。由圖2可知，各采樣點樣本中相對豐度高于5%的細菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)，其中變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍細菌門相對豐度分別為16.96%～34.30%、9.16%～21.91%、9.48%～26.06%、11.18%～48.07%，為主要優勢門。樣本中相對豐度高于5%的細菌屬為norank_f_FamilyⅠ、norank_c_Cyanobacteria、CL500-29_marine_group、聚球藻屬(Synechococcus)、MWH-UniP1_aquatic_group、紅細菌屬(Rhodobacter)、Candidatus_Aquiluna、norank_f_OPB56、norank_o_PeM15、嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、norank_f_Saprospiraceae。不同采樣點細菌優勢屬存在較大差異，5個采樣點第一優勢屬及其相對豐度分別為紅細菌屬(10.82%)、嗜氫菌屬(11.10%)、norank_f_FamilyⅠ(8.31%)、norank_f_FamilyⅠ(19.34%)、norank_f_FamilyⅠ(6.10%)。

注：為方便細菌優勢種觀察，將不同采樣點相對豐度均低于5%的門(屬)列為others。圖2 夏季門和屬分類水平下的細菌組成Fig.2 Bacterial population composition at phylum and genus level in summer

2.3.2秋季細菌種群組成

對秋季樣本OTU進行物種分類統計，共得到細菌34門、520屬、786種。秋季門和屬分類水平下各采樣點的細菌優勢種組成如圖3所示。由圖3可知，各采樣點樣本中相對豐度高于5%的細菌門均為變形菌門、藍細菌門、放線菌門、擬桿菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)，其中變形菌門、放線菌門、擬桿菌門相對豐度分別為17.45%～67.78%、3.39%～31.22%、3.76%～11.71%，為主要優勢門。樣本中相對豐度高于5%的細菌屬為聚球藻屬、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、unclassified_f_FamilyⅠ_o_SubsectionⅠ、ML602J-51、紅細菌屬、norank_c_Cyanobacteria、Candidatus_Aquiluna、norank_o_PeM15、norank_f_LD29、unclassified_f_Rhodobacteraceae、紫桿菌屬(Porphyrobacter)、unclassified_f_FamilyⅠ_o_SubsectionⅢ、unclassified_f_Verrucomicrobiaceae，其中unclassified_f_FamilyⅠ_o_SubsectionⅠ、ML602J-51、聚球藻屬為主要優勢屬；5個采樣點第一優勢屬及其相對豐度分別為紅細菌屬(14.56%)、嗜冷桿菌屬(44.09%)、聚球藻屬(21.31%)、聚球藻屬(25.03%)、聚球藻屬(14.03%)。

注：同圖2。圖3 秋季門和屬分類水平下的細菌種群組成Fig.3 Bacterial population composition at phylum and genus level in autumn

2.3.3夏秋季細菌種群組成的比較

在門分類水平下，夏秋兩季水體藍細菌門不具有優勢豐度，而變形菌門、放線菌門和擬桿菌門均具有較高的相對豐度，但2個季節及同一季節的不同采樣點各門相對豐度均存在一定差異。在屬分類水平下相對豐度高于5%的細菌屬中，聚球藻屬、紅細菌屬、norank_c_Cyanobacteria、Candidatus_Aquiluna、norank_o_PeM15為夏秋兩季的共有屬，另外一些細菌屬為夏季或秋季的特有屬，如嗜氫菌屬、黃桿菌屬在夏季W2采樣點相對豐度分別為11.10%、7.49%，而在秋季各采樣點中均未檢測到；嗜冷桿菌屬在秋季W2采樣點具有極高的相對豐度(44.09%)，但在夏季各采樣點均未檢測到。嗜氫菌屬為夏季潛流濕地區W2采樣點的特有屬，嗜冷桿菌屬為秋季潛流濕地區的特有屬，它們在人工濕地中對污染物的降解作用值得進一步研究。norank_f_Family Ⅰ為夏季W3～W5采樣點的第一優勢屬，相對豐度分別為8.31%、19.34%、6.10%，而在秋季各采樣點均未檢測到；unclassified_f_Family Ⅰ_o_Subsection Ⅰ在秋季W3～W5采樣點存在且具有較高的相對豐度(8.77%～12.13%)，但在夏季各采樣點均未檢測到。各采樣點中，只有W1采樣點在夏秋兩季均具有相同的第一優勢屬(紅細菌屬)，相對豐度分別為10.82%、14.56%，但其他采樣點第一優勢屬及其相對豐度均存在較大差異性。

在OTU水平下繪制物種Venn圖，結果如圖4所示。由圖4可見，濕地公園不同采樣點細菌夏季共有種為187種，秋季為110種，這可能是由于夏季水量充足，水流相對較大，細菌隨水流在濕地內轉移，較秋季容易生長。夏季各采樣點中，W1采樣點與其他4個采樣點細菌共有種最少，其與W2、W3、W4、W5采樣點細菌共有種分別為311、287、242、264種；W3、W4、W5采樣點細菌組成相似度最高，共有種高達560種，分別占各采樣點物種數的81.0%、90.5%、82.1%。秋季各采樣點中，W2采樣點與其他4個采樣點細菌共有種最少，其與W1、W3、W4、W5采樣點細菌共有種分別為238、194、190、204種；W3、W4、W5采樣點在秋季同樣具有極高的細菌組成相似度，共有種高達416種，分別占各采樣點物種數的69.0%、73.2%、57.5%。表明W3、W4、W5采樣點細菌種群組成相似性較強，且受季節影響程度相對較小，季節影響下的細菌種群特征差異主要體現在W1和W2采樣點。

圖4 OTU水平下的物種Venn圖Fig.4 Venn diagram of species at OTU level

總的來說，濕地公園內細菌優勢門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門，其中變形菌門為第一優勢門，這與已有研究結果[27-29]一致。變形菌門在各類環境包括水體、沉積物中普遍存在,是細菌中最大的類群[27-29],變形菌門中的蔓生根瘤菌屬、紅假單胞菌屬、固氮螺菌屬等存在著多樣的nifH基因，參與編碼鐵蛋白固氮酶，可參與環境中分子態氮轉化為銨態氮的過程，是重要的固氮微生物[30]；變形菌門在太平洋深海沉積物的生物地球化學過程中發揮著重要作用[31-32]，也是生物膜反應器脫氮除磷工藝中生物膜上的重要微生物組分，對于氮、磷等污染物的降解扮演著重要作用[33-34]。因此，細菌中變形菌門的大量存在保證了濕地系統的良好運行。放線菌門同樣也是氮、磷去除工藝中生物膜上的重要微生物組分[30]，如彭云等[35]從連云港海域分離得到一株放線菌BM-2，探究發現該菌株具有固氮、降解有機磷等能力，證實了放線菌的脫氮除磷能力；同時放線菌對于纖維素具有顯著的降解作用[36]，該作用在高溫及高堿等極端環境下也能進行；放線菌還可產生色素[37]，任意分解有機物、固定礦物質，對污水處理和環境保護具有較為重要的作用；此外，放線菌在發酵纖維素的過程中還可以產生能源[38]，如Chanthasena等[39]從泰國東北部森林土樣中分離出的放線菌，其代謝產物還可用于抗生物耐藥性新藥的開發。擬桿菌門的細菌是復雜碳水化合物的多產降解者[40]，大多數細菌能將纖維素降解成可溶性糖類，還可以參與到枯枝落葉分解的碳循環中[41-42]，大多數擬桿菌屬細菌對于人類和動物的腸道健康至關重要，但也含有潛在致病BFG細菌[43-45]。擬桿菌門也是濕地系統中常見的優勢門，受環境和營養條件影響，其在不同環境介質中的相對豐度也存在差異，如遼東灣濱海濕地中擬桿菌門在根系附著物樣品中占16.33%，而在根系土壤樣品中占37.47%[46]。本研究檢測得到的其他細菌門，其組成和相對豐度同樣受到環境和營養條件影響，同時也能在一定程度上反映水質以及濕地系統的穩定性。如藍細菌門數量激增可引起水質惡化、藍藻水華現象頻發[47-48]，因此藍細菌門的豐富度情況可作為水質預警的標準之一；綠菌門和疣微菌門與已有的濕地細菌多樣性的研究結果一致[49]，具有一定豐富度但不構成主要優勢菌，其中綠菌門能在有光照和無氧條件下利用硫化物作為電子供體進行生長[50]，可參與濕地系統中硫酸鹽化合物的降解，而對于疣微菌門的功能研究相對較少；厚壁菌門是一類與好氧發酵堆肥中木質纖維素降解有關的細菌菌群[51-53]。除了上述優勢細菌外，濕地水體還存在著相對豐度較低的其他種群以及尚未在基因庫中獲得命名的新物種，其是濕地生態系統中食物鏈和食物網的重要組成部分，在C、N、P、S等元素的生物地球化學循環中也發揮著關鍵作用[54-56]。

2.4 細菌種群組成的環境影響因素分析

注：圖(a)PC1為48.63%,PC2為30.29;圖(b)PC1為68.22%,PC2為27.55%。圖5 細菌物種組成與環境因子間的主成分分析Fig.5 Principal component analysis between bacteria species composition and environmental factors

3 結論

(1)天津臨港濱海濕地公園水體夏季細菌Shannon多樣性指數為4.25～5.14，種群豐富度Chao指數為569.10～894.04，物種數Sobs指數為446～757；秋季細菌Shannon多樣性指數為3.07～4.32，Chao指數為473.22～995.81，Sobs指數為361～678。細菌多樣性夏季高于秋季，種群豐富度則季節性差異不顯著。

(2)濕地公園水體夏季共檢測到細菌34門、423屬、641種，主要優勢門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍細菌門，主要優勢屬有紅細菌屬、嗜氫菌屬、norank_f_FamilyⅠ；秋季共檢測到細菌34門、520屬、786種，主要優勢門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門，主要優勢屬為unclassified_f_FamilyⅠ_o_SubsectionⅠ、ML602J-51、聚球藻屬(Synechococcus)。夏秋兩季細菌種群組成差異主要體現為優勢細菌屬的不同，另外只在夏季檢測到嗜氫菌屬和黃桿菌屬，只在秋季檢測到嗜冷桿菌屬，且具有較高的相對豐度。

(3)濕地公園不同功能區水體細菌種群組成存在明顯差異。景觀水體區和出水口細菌在物種組成上具有極大相似性，且與濕地進水口、潛流濕地區具有明顯差異。景觀水體區、濕地出水口采樣點細菌共有種在夏季和秋季分別高達560和416種，且細菌優勢屬夏季均為norank_f_FamilyⅠ，秋季均為聚球藻屬；而濕地進水口、潛流濕地區采樣點在夏秋兩季細菌組成變化明顯，細菌優勢屬在夏季為紅細菌屬、嗜氫菌屬，而秋季為紅細菌屬、嗜冷桿菌屬。