微生物-腸-腦軸調控蛋雞應激性異常行為的研究進展

鄒昕羽 CHENG Hengwei 金美蘭 江 莎，3*

(1.西南大學動物醫學院動物健康與動物性食品安全國際合作聯合實驗室，重慶 2400715；2.美國農業部農業研究所，西拉斐特 2479072；3.西南大學醫學研究院免疫學研究中心，重慶 2402460)

隨著社會的發展，人們對動物源性產品數量和質量要求不斷提高。為了滿足人們的需求，養殖業根據畜禽生產性能進行品系篩選，然而在選育過程中，由于片面重視高生產性能，忽視了其他性狀，動物往往因生產或繁殖性狀過度表現而出現免疫抑制、功能障礙、代謝紊亂、應激敏感[1-2]和行為異常增加等情況，這損害了動物健康和福利[3]。現代養禽業普遍采用高密度集約化飼養管理模式。在蛋雞飼養過程中，飼養群體越大，社會等級秩序穩定性越差，動物情緒緊張度越高，導致傷害性行為發生頻率增加[4]。飼養過程中的轉舍和斷喙等管理措施也易誘發蛋雞出現應激反應，導致動物出現異常行為。研究發現，動物出現應激反應并伴隨異常行為時，腸道菌群多樣性也遭受破壞，出現腸道炎癥，引起機體局部或系統性感染[5]。

最新國內外研究表明，微生物-腸-腦軸可影響宿主的社會行為[6]。腸道菌群被視為一個跨物種的虛擬內分泌器官，其分泌各種生物活性物質，作用于大腦，調節生物的應激反應和相關行為[7]。Münger等[6]提出，腸道菌群和社會行為之間存在密切聯系，腸道菌群可影響宿主社會行為，而群體間的社會結構和交流可改變腸道菌群組成。慢性應激會破壞腸穩態和緊密連接，增加腸道通透性，形成“腸漏”，導致大量病原菌和有毒代謝產物滲透進入血液，造成神經炎癥、精神障礙和異常行為[8]。同時，研究發現腸道有益菌具有調節免疫[9]、吸收代謝[10]和神經內分泌[7]等功能，例如食品添加劑中的益生菌通過調節腸道微生物群的結構和多樣性來影響宿主的微生物-腸-腦軸，從而達到預防或抑制精神疾病的目的[11]。

1 蛋雞的應激及其異常行為

野生動物在經過千百年的人工圈養和選育后被馴化為家畜家禽。在被馴化過程中，為了適應人工飼養環境和管理措施，動物依賴基因序列或非基因序列的改變(如DNA甲基化)而改變基因表達水平，調整物種的生理活動和行為方式。但是，并不是所有畜禽最終都能完全適應環境變化，在某些環境影響下，被沉默的不利基因還可能被喚醒，導致動物不適應人工飼養環境，而出現過度應激或應激性異常行為。

1.1 應激

應激是身體對各種緊張性刺激的非特異性反應，是動物得以生存的重要因素之一，可增加動物的適應性和存活率。對個體產生積極作用的應激被定義為恰當應激或正向應激，而產生消極影響性質的應激為負向應激或過度應激。現代蛋雞養殖采用分階段飼養制度，這導致蛋雞一生通常需經歷1～2次轉群，在陌生環境和與不熟悉雞混群的共同刺激下雞易產生急性應激。傳統籠養模式下，高密度飼養和有限的活動空間限制了雞的覓食、探索、棲息、沙浴和筑巢等自然行為，這些自然行為的減少或缺失可共同誘發慢性應激[12]。雞只產生過度應激時會出現生理障礙和代謝紊亂，尤其會造成胃腸道結構功能以及微生物菌群紊亂，如：1)腸道共生菌的種類和定植數量被破壞，原微生物菌群平衡被打破，有益菌群減少，有害菌群及其毒力增加，誘發腸道炎癥；2)病原菌的存活率和侵襲力增加；3)營養物質的吸收受阻；4)擾亂腸道微生物產生γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、多巴胺(dopamine，DA)和去甲腎上腺素(noradrenaline，NE)等具有神經遞質功能的物質；5)破壞腸道屏障功能，增加腸道通透性，使病原菌能夠透過腸道屏障，造成宿主的代謝紊亂并誘發敗血癥；6)損傷上皮細胞，產生自由基并降低抗氧化能力造成氧化應激[13-16]，最終影響動物的健康。同時，各種應激源的過度刺激會導致動物表現出啄羽、攻擊和同類相食等異常行為。

1.2 啄癖

啄羽是一種表現為籠養蛋雞反復不停地啄彼此羽毛的異常行為。在籠養體系中有80%的蛋雞會有不同程度的啄羽行為，它包括輕啄和重啄2類。輕啄是反復啄羽毛的尖端和邊緣，一般是正常表現[17]。重啄是指雞用力啄并拉扯羽毛，甚至吃掉羽毛的行為[18]。產蛋后突出的泄殖腔和受損出血的皮膚是啄羽出現的一個誘因，雞只會攻擊受傷的同伴，甚至出現同類相食的現象[19]。啄羽行為能使雞只大腦釋放大量DA，過多的DA通過與神經元受體結合，產生一系列強烈且短暫的快感并使動物上癮，造成啄羽行為的進一步強化。并且，啄羽行為還能通過學習行為在種群內傳播，導致雞群同類相食、產蛋量下降和死亡率增加[20]，給生產造成嚴重的影響。所以啄羽，尤其是重啄，一直是影響家禽健康和福利的主要原因之一。

1.3 攻擊行為

陌生的個體被迫混群時，為了建立新的社會優勢序列，常引發爭斗行為，雞會直接攻擊性叨啄同類的頭、趾及肛門等部位，造成不同程度的傷亡，但優勢序列重新建立后，整個群體社會關系會保持相對穩定[21]。根據自然法則學說，動物的生產力和其競爭力相關。因現代選育主要針對高生產力的個體，這導致了動物群體處理環境和生理問題的能力減弱，并相對增加了動物的競爭性和攻擊性。調查發現，經過20多年人工選擇的商業蛋雞DeKalb XL的產蛋量顯著增加，但因攻擊行為和同類相食導致的死亡率也相應增加了約10倍[22]。根據“挫折-攻擊理論””，即在遇到挫折時會有潛在的攻擊性傾向，當雞群處于如傳統籠養等空間限制性環境下，雞展示它們自然行為的權利被剝奪，面對一成不變的環境，沒有新鮮事物的刺激，動機得不到滿足，雞群會因此陷入一種沮喪狀態，從而引起應激反應并伴有攻擊性[23]。

2 應激調控系統

脊椎動物在神經網絡及刺激反應上具有高度相似性，均受大腦神經網絡和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、DA等激素分泌量的共同影響，且鳥類核心的“社會行為網絡”與哺乳動物類似[24]，即鳥類控制情緒和行為(對環境刺激的反應)的大腦結構和功能與哺乳動物相似，例如下丘腦、后背腹嵴(與哺乳動物的杏仁核同源)和中縫核[25]，另外鳥類神經遞質受體如5-HT受體等的分布也與哺乳動物類似[26]。因此，蛋雞對應激源的反應與哺乳動物類似，都分別由下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸和交感-髓質-腎上腺(sympathetic-medullary-adrenal，SMA)軸這2個主要的應激反應系統來調控。HPA軸作為一個神經內分泌系統，其功能是調控長時間持續累積的應激反應，而SMA軸的功能是調控一個短期的“戰斗或逃避”反應。在應激刺激下，神經內分泌的穩態發生改變，由HPA軸調控釋放的皮質酮(corticosterone，CORT)和SMA軸釋放的兒茶酚胺神經肽包括DA、腎上腺素(epinephrine，EN)和NE的濃度發生改變，多種激素共同調控動物的病理性生理狀態和行為[27]。

2.1 CORT與應激反應強度

CORT是腎上腺受到刺激時產生的一種皮質激素，血漿中CORT的濃度常被當作判斷應激反應強度的指標。研究表明，CORT可以通過與大腦中的受體結合，影響如下丘腦和中縫核中5-HT的合成、代謝及其受體密度[28]，最終調節和改變生物的生理功能和行為。Davies等[29]研究發現，鳥類領地行為的攻擊性強弱與CORT濃度有關且在雞胚胎發育期間暴露于過量的CORT會改變雞的HPA軸活性和5-HT能系統的功能，使出生3周的雞攻擊頻率增加[30]。

2.2 DA與應激反應強度

DA參與調節攻擊性和防御性行為，DA的濃度也已被用作應激反應的指標[31]。具有攻擊性行為的日本鵪鶉的大腦中發現了高濃度的DA[32]。Dennis等[33]指出，給予DA D1受體激動劑后，蛋雞的攻擊性增加，而DA D2受體激動劑作用效果因各自品種的攻擊性強度不同而不同。同樣，使用DA D2受體拮抗劑后蛋雞攻擊性行為下降，且相應下丘腦中5-HT和EN濃度升高。DA D2受體基因是與人類異常行為有關的為數不多的單位點基因座之一，因此推斷它可能與禽類啄癖、同類相食等異常行為有關。

2.3 EN和NE與應激反應強度

EN和NE與CORT一樣，被稱為“應激激素”。急性應激會導致動物血漿中NE濃度增加，其升高程度可以反映應激刺激的強度。研究表明，EN和NE參與并控制行為、情緒和對應激源的適應能力，如通過臨床和試驗研究發現下丘腦NE釋放量增加與血清中CORT濃度和焦慮樣行為有關[34]。同時大量證據表明，有抑郁、焦慮等精神疾病的患者，大多出現NE能系統和5-HT能系統紊亂的現象[35]，并且5-HT-NE再攝取途徑已成為創傷后應激障礙心理治療的目標[36]。

2.4 5-HT與應激反應強度

無論脊椎還是無脊椎動物，大腦中5-HT對社會行為尤其是攻擊性行為起著重要的作用。研究表明，攻擊性強的動物大腦(包括下丘腦)中5-HT濃度較低[37]，增加大腦(側下丘腦和杏仁核)5-HT和/或5-羥吲哚乙酸(5-HIAA，5-HT代謝終產物)濃度可阻止或抑制嚙齒動物的掠食性攻擊行為[38]。補充色氨酸(5-HT合成前體)可顯著降低豬的攻擊性行為[39]，限制雄性雞和雌性雞的傷害性啄斗[40]。此外，5-HT1和5-HT2受體的功能也與攻擊性有關，當5-HT受體功能受損或5-HT1受體基因被敲除時攻擊性會隨之增強[41]。所以腦中5-HT及其代謝物的濃度和5-HT受體的密度，被用作衡量試驗動物攻擊行為強度的重要指標，也是篩選溫良蛋雞的生物標志物，以此來避免蛋雞斷喙，減輕生產中的痛苦[42]。

研究發現，應激反應如CORT、5-HT濃度的改變會影響腸道菌群的組成[43]，同時腸道菌群又會反向影響HPA軸的敏感性、神經發育和行為[44]，以此有人提出微生物-腸-腦軸雙向交流的概念。

3 微生物-腸-腦軸對雞應激及其異常行為的影響

腸道菌群像一個內分泌器官一樣可通過腸-腦軸的雙向通訊整合來自代謝、免疫、內分泌和神經通路發出的信號，并通過腸神經、迷走神經等外周神經系統、激素信號、免疫系統和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)等微生物代謝產物反向調節微生物-腸-腦軸的病理性生理功能，影響宿主的行為和健康[45]。人類腸道菌群的改變與各種神經變性或神經炎癥引起的抑郁和精神紊亂有關[46]，也對宿主的攻擊行為、焦慮癥及相關社會行為有潛在的影響[47]。同樣的，腸道菌群被視為一種“虛擬內分泌器官”也會影響禽類的健康[48]，并且有研究發現啄羽嚴重程度不同，蛋雞腸道內微生物多樣性也不同[49]。

3.1 微生物-腸-腦軸改善禽類應激狀態及其異常傷害行為

研究證明，動物行為異常會引起腸道菌群結構改變。Chen等[50]研究發現，當表達自然行為的能力被抑制時，蛋雞會產生慢性應激，出現假沙浴行為，腸道微生物群落多樣性降低，造成微生物在屬和種水平上籠養雞與散養雞的顯著差異。重啄蛋雞腸內梭菌屬相對豐度比輕啄蛋雞高，但葡萄球菌和乳酸菌相對豐度較低[51]。腸道菌群與行為之間的影響是相互的，無菌鼠定植特定益生菌后可糾正社會壓力引起的HPA軸過度反應[52]，顯著減弱家鼠類似強迫癥行為[53]。雞作為社會性動物，在新環境下會表現出恐懼、抑郁或焦慮等異常心理，并且為了在陌生群體中建立新的社會秩序常常會攻擊同伴。Cheng等[54]研究發現，枯草芽孢桿菌可以減少蛋雞的攻擊行為，顯著減少優勢蛋雞的威脅性踢踹次數和啄頭、啄羽頻率，且優勢蛋雞攻擊行為的減弱與飼喂益生菌后血液中5-HT濃度的下降有關。研究還發現，枯草芽孢桿菌可以改善熱應激行為和炎癥反應，減少喘氣、打盹、飲水的次數，增加行走、覓食的時間[55]。因此，人們提出可通過改善人類和蛋雞等動物[48]腸道菌群和腸穩態來調節腸-腦軸功能，從而防止或減少過度應激誘導的異常行為和精神障礙的出現。

3.2 微生物-腸-腦軸改善蛋雞的應激狀態及其相關異常行為的機制

3.2.1 迷走神經

迷走神經是微生物群與大腦溝通的一條途徑，是連接腦干孤束核和胃腸道的主要神經通路。Kaelberer等[56]研究發現，迷走神經節神經元可與腸上皮內分泌細胞形成突觸，以谷氨酸為神經遞質，將腸道刺激信息直接傳遞給大腦；另外，微生物的代謝產物可刺激腸上皮內分泌細胞的分泌和通過迷走神經間接影響大腦，從而控制行為。Pradhananga等[57]研究發現，腸道共生菌半胱氨酸蛋白酶和大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可分別通過激活蛋白酶激活受體-2和神經元上Toll樣受體4增強迷走神經元的興奮性，細菌代謝物吲哚可通過刺激腸內分泌細胞分泌神經遞質胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)間接調節迷走神經傳入活動[58]；同樣研究表明，雞腸腔內分泌細胞，即L細胞，在形態結構與功能上與哺乳動物類似，可以對消化道內的賴氨酸、蛋氨酸等蛋白質及微生物代謝產物做出反應，通過分泌GLP-1控制雞的食欲及攝食行為[59]。Bravo等[60]研究發現，鼠李糖乳桿菌可減少應激誘導的CORT，矯正焦慮、抑郁等行為，但切除小鼠膈下迷走神經后鼠李糖乳桿菌對行為的矯正作用消失；同樣，雙歧桿菌NCC3001對小鼠焦慮行為的矯正作用也因膈下迷走神經的切除而消失[61]，從而證實了迷走神經這一傳導途徑。但并不是所有腸道微生物均通過迷走神經這一條途徑來影響大腦和行為。

3.2.2 微生物代謝

色氨酸是腸道益生菌最常見的代謝產物之一，是5-HT合成的限速底物，它可穿過血腦屏障直接影響中樞5-HT的合成[62]，參與宿主情緒和認知調控。研究發現，飼喂富含色氨酸飼糧的動物(如豬、鼠和雞)會出現下丘腦中5-HT活性(5-HT/5-HIAA)增強，使處于重新混群的動物應激反應強度降低[63]。飼喂益生菌能夠增加小鼠紋狀體中5-HT的含量以及5-HT相關合成酶的表達[64]，改善無菌小鼠的焦慮行為[65]。5-HT對應激的鎮靜作用在雞身上同樣適用[66]，枯草芽孢桿菌可提高肉雞中縫核中5-HT的濃度，并且使下丘腦中應激相關內分泌物NE和DA濃度顯著降低[67]。Van Hierden等[68]研究指出，5-HT可能通過DA能系統發揮作用，通過減少DA神經傳遞顯著降低蛋雞的啄羽頻率。

SCFAs是腸道菌群另一主要代謝產物，包括丁酸鹽、丙酸鹽及乙酸鹽等。SCFAs是腸道和大腦溝通的關鍵分子，可影響中樞免疫系統發育、神經遞質傳導等生理過程。SCFAs可調節中樞神經系統中小膠質細胞的成熟和功能，改善無菌小鼠小膠質細胞的缺陷[69]；參與神經遞質的產生，如哺乳動物主要通過游離脂肪酸受體2(free fatty acid receptor 2，FFAR2)或G蛋白偶聯受體41的激活刺激腸內分泌細胞L細胞分泌GLP-1和酪酪肽，但與哺乳動物不同，Zhang等[70]已研究證實SCFAs中乙酸鹽對雞FFAR2刺激作用最強，且SCFAs誘導的GLP-1的分泌主要通過細胞增殖調節因子——細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)通路的激活；通過組蛋白去乙酰化酶治療無菌(GF)小鼠額皮質組蛋白乙酰化缺失、長期社會壓力引起的HPA軸功能亢進和焦慮、抑郁樣行為[71-72]。研究表明，在粗暴運輸造成的應激下，雞HPA軸亢進，CORT濃度升高，采食攝水量下降，腸道產SCFAs水平顯著降低，而添加乳酸菌可以通過產生乳酸和丙酸鹽恢復SCFAs水平[73]。并且，Tian等[74]研究指出，抑郁癥患者腸道中SCFAs水平下降，雙歧桿菌同樣可以提高丁酸鹽含量并降低血清CORT濃度，顯著減少小鼠的抑郁行為。但由于SCFAs的半衰期很短，微生物代謝所產生的濃度是否足夠影響大腦的研究還并不清楚。此外，研究發現腸道菌群內含特定的酶可以促進多酚及其中間代謝物的生物轉化，提高多酚的生物利用度，通過調控促炎因子誘導的犬尿氨酸代謝通路(與色氨酸合成5-HT途徑互為競爭關系)的活性，調節抑郁癥患者大腦中5-HT濃度，減少神經炎癥，并改善認知障礙[75]。

3.2.3 免疫調節

腸道微生物群對免疫系統的發育至關重要，正常微生物的定植可矯正無菌小鼠的部分免疫功能異常，尤其是改善神經炎癥相關的小膠質細胞的整體缺陷[69]。研究表明，異常應激誘導的抑郁患者具有高水平的促炎性因子，這些促炎性因子可通過刺激HPA軸的活性進一步增加動物和人的焦慮樣行為，而服用抗炎藥物可明顯促進患者康復。過度應激能損壞腸黏膜屏障，并且增加腸道通透性，使內毒素進入血液循環系統并激活小膠質細胞，導致長期的神經炎癥，使神經遞質如5-HT、DA和NE合成受阻，影響大腦活動[76]。而益生菌可以逆轉雞應激導致的連接黏附分子2(junctional adhesion molecule 2，JAM2)、緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)、黏液蛋白2(mucin 2，MUC2)等緊密連接蛋白基因表達的降低[77]，阻止雞熱應激腸道中肥大細胞數目的增多，有效減少組胺和類胰蛋白酶的釋放量[78]，降低腸道通透性。抗菌肽是腸內潘氏細胞分泌的小分子，雞的主要抗菌肽是防御素和cathelicidin(CATH)，益生菌可以顯著提高CATH1、CATH2在雞腸黏膜中的表達[78]，益生菌如乳酸菌同樣可以產生相應的抑/抗菌物質，如細菌素、有機酸等[79]，增強腸道黏膜免疫功能，抵抗LPS和病原菌的入侵，共同阻止內毒素血癥的發生。Chang等[79]研究發現，給無特定病原體(SPF)雞添加混合益生菌可顯著增加腸內SCFAs水平，使盲腸扁桃體中抗炎因子白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達增加，促炎因子干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)表達減少。同樣，添加地衣芽孢桿菌可以使熱應激的雞血清中白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促炎因子水平正常化，血清CORT濃度降低，從而改善應激行為[78]。研究發現，益生菌也可以通過產生SCFAs和參與色氨酸分解代謝，產生吲哚3醛，介導核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的激活，抑制促炎因子的表達，同時抑制小膠質細胞的激活并恢復認知功能[80]。

3.2.4 神經營養因子

腦源性神經營養因子(neurotrophic factor，BDNF)、神經營養因子3(neurotrophins-3，NT-3)是表達最廣泛的神經營養因子，參與調節中樞神經系統中神經元的存活、分化以及突觸的傳遞和可塑性功能。研究發現，體內注射BDNF可以增強雛雞的記憶力，對被動回避學習有更強的保留力[81]，但在雞隔離應激試驗中，出現海馬體中BDNF含量下降并伴隨重度抑郁行為的出現[82]，并且海馬體中BDNF的缺失會導致認知和學習能力障礙以及多種精神疾病[83]；然而給海馬體內低水平BDNF的無菌小鼠定植雙歧桿菌或SPF小鼠的糞便可以使BDNF的水平恢復以及應激后行為正常化[44]；Tian等[84]研究發現雙歧桿菌可以通過5-HT1A-cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)-BDNF途徑增加大腦前額皮質中BDNF的含量，減輕HPA軸亢進反應，逆轉周圍炎癥狀態，改善應激誘導的抑郁行為和神經異常；益生菌還可通過增加腦內神經營養因子的含量誘導海馬體神經元對BDNF的釋放，從而調節動物情緒[85]。

4 小 結

腸道菌群在宿主對急性和慢性應激的反應中起著重要的作用。社會壓力誘導的腸道菌群的變化會導致炎癥反應和細菌代謝物的“泄露”，從而影響大腦的功能尤其是HPA軸和SMA軸功能的紊亂。這些變化會對生理和行為穩態造成負面的影響，最終導致包括攻擊性增加、異常行為以及精神障礙的出現。大量研究結果表明，膳食中添加的益生菌可以通過調節迷走神經、代謝產物和免疫等機制調節5-HT能系統等，減少動物應激引起的異常行為。但目前該領域的研究主要針對人類和哺乳動物，雖然雞與哺乳動物部分組織器官具有相似或同源性，但特異性微生物菌群和具體機制研究是否有區別還知之甚少。篩選合適的益生菌，深入研究微生物-腸-腦軸對蛋雞抗應激和傷害性行為的影響，有助于推廣益生菌在禽類飼養管理中的應用，避免斷喙等爭議性管理手段的使用，減少因密集籠舍飼養或選擇性繁育造成的傷害性行為及經濟損失。