甜菜堿對脂多糖刺激仔鵝生長性能、器官指數、血清生化指標及脾臟炎性因子表達的影響

陽金金 楊 芷 楊 雨 梁靜茹 肖 霞 楊海明* 王志躍，

(1.揚州大學動物科學與技術學院，揚州 2225009；2.揚州大學農業科技發展研究院，揚州 2225009)

現代肉鵝高度集約化生產模式下，產量快速增長的同時也伴隨著免疫應激的增多，如病原微生物、疫苗接種、運輸及環境污染等諸多因素都會引起免疫應激[1]。免疫應激嚴重影響肉鵝生長性能并導致炎癥反應的發生[2]。因此，采取一定措施緩解免疫應激，對提高生產效益和保障肉鵝健康具有重要意義。目前，通過營養調控來緩解免疫應激已成為動物營養學的重要研究方向[3]。

甜菜堿(betaine，Bet)又稱為三甲基甘氨酸，最早從甜菜副產物中提取而來，廣泛分布于動物、植物和微生物中，具有甲基供體和滲透調節功能[4]。Wang等[5]研究顯示，飼糧中添加0.05%甜菜堿提高了肉鴨前期生長性能。Chen等[6]研究表明，飼糧中添加0.05%和0.10%甜菜堿有利于改善肉雞生長性能。楊雨等[7]研究同樣表明，飼糧中添加0.06%～0.18%甜菜堿有利于提高仔鵝前期生長性能。甜菜堿在酒精性或非酒精性脂肪肝、癌癥、糖尿病等疾病中發揮抗炎作用[8-11]，主要與甜菜堿能抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族熱蛋白結構域3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體活性、調節能量代謝以及減輕細胞凋亡有關[12]。結合甜菜堿的特性與生產中的研究，人們發現飼糧中添加甜菜堿有利于畜禽緩解多種應激[13-14]。因此，本試驗通過研究飼糧中添加甜菜堿對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激仔鵝生長性能、器官指數、血清生化指標及脾臟炎性因子表達的影響，以闡明甜菜堿對仔鵝免疫應激反應和生長性能的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜菜堿為昕洋堿750，有效成分含量為75%，購自北京某科技發展有限公司。LPS來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)O55∶B5，有效成分含量為97%，購自美國Sigma-Aldrich公司。試驗動物為168只15日齡體重相近且健康的江南白鵝公鵝，其試驗前的飼養管理一致。

1.2 試驗設計與飼養管理

試驗采用2×2雙因子隨機設計，主因子分別為LPS(腹腔注射LPS或生理鹽水)和甜菜堿(飼糧中不添加或添加0.06%甜菜堿，添加量參照楊雨等[7])。試驗選取168只15日齡的江南白鵝公鵝，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復7只鵝。試驗設計見表1。

分別于16、18、20日齡早晨對試驗鵝進行LPS刺激，注射劑量與時間參照Yang等[15]，21、28日齡稱重、屠宰采樣。試驗分為應激期(16～21日齡)和恢復期(22～28日齡)，試驗期13 d。試驗鵝網上平養，飼喂干粉料，自由采食、飲水，自然光照。其他飼養管理按常規進行。

飼糧配方主要參考揚州大學家禽生產與營養實驗室歷年的研究成果[16-17]，以玉米、豆粕為基礎原料配制基礎飼糧，基礎飼糧組成及營養水平見表2。

表2 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能

分別于21和28日齡，按重復對試驗鵝進行稱重(空腹6 h)并記錄，統計各組試驗鵝的采食量和增重情況，并計算應激期和恢復期的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.3.2 免疫器官指數

分別于21和28日齡，從各重復選取接近平均體重的試驗鵝1只，屠宰后迅速完整剝離并摘取胸腺、脾臟和法氏囊，剔除脂肪和其他黏附組織，稱重并計算免疫器官指數。

免疫器官指數(g/kg)=免疫器官
重(g)/活體重(kg)。

1.3.3 血液指標

分別于21和28日齡，翅靜脈采血并分離血清，用UniCel DXC 800 Synchron全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)含量，并計算白蛋白/球蛋白(白球比，A/G)。

1.3.4 脾臟炎癥因子mRNA相對表達量

分別于21和28日齡，從各重復選取接近平均體重的試驗鵝1只，屠宰后迅速無菌采集脾臟組織，液氮速凍后立即置于-70 ℃冰箱，用于測定脾臟炎癥因子mRNA相對表達量。用總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取脾臟中總RNA，用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，用反轉錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行反轉錄，得到的cDNA稀釋后通過CFX ConnectTM實時熒光定量PCR儀對脾臟炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及轉化生長因子-β(TGF-β)mRNA相對表達量進行相對定量分析，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因，基因引物信息見表3。反應體系為20 μL：SYBR Green PCR Master Mix (2×) 10 μL，上、下游引物各1.4 μL，cDNA模板1 μL、無酶水6.2 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火10 s，共39個循環。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表3 基因引物信息

1.4 數據統計分析

試驗數據采用Excel 2017進行初步整理，利用SPSS 20.0統計軟件的一般線性模型(GLM)程序進行雙因素方差分析，模型主效應包括LPS、甜菜堿及兩者的互作效應。當有互作效應時，采用Duncan氏法進行多重比較。結果用平均值和均值標準誤(SEM)表示。P≤0.05表示差異顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 甜菜堿對LPS刺激仔鵝生長性能的影響

如表4所示，在應激期，LPS刺激顯著降低仔鵝21日齡體重、ADFI和ADG(P≤0.05)，顯著提高F/G(P≤0.05)，而添加甜菜堿具有提高仔鵝21日齡體重(P=0.090)和ADFI(P=0.080)的趨勢，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝21日齡體重有互作效應趨勢(P=0.075)，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝ADFI有顯著互作效應(P≤0.05)。這表明飼糧中添加甜菜堿可以緩解由LPS刺激引起ADFI的降低。

表4 甜菜堿對LPS刺激仔鵝生長性能的影響

在恢復期，LPS刺激顯著降低仔鵝28日齡體重、ADFI和F/G(P≤0.05)，對ADG無顯著影響(P>0.05)；添加甜菜堿對仔鵝恢復期生長性能無顯著影響(P>0.05)。

2.2 甜菜堿對LPS刺激仔鵝器官指數的影響

如表5所示，21日齡時，LPS刺激顯著降低仔鵝胸腺指數(P≤0.05)，而添加甜菜堿顯著提高了仔鵝胸腺指數(P≤0.05)。LPS刺激和添加甜菜堿對各器官指數均無顯著互作效應(P>0.05)。

表5 甜菜堿對LPS刺激仔鵝器官指數的影響

2.3 甜菜堿對LPS刺激仔鵝血清生化指標的影響

如表6所示，21日齡時，LPS刺激顯著降低仔鵝血清白蛋白含量和白球比(P≤0.05)，顯著提高血清球蛋白含量(P≤0.05)；LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝血清白蛋白含量有顯著互作效應(P≤0.05)。這表明飼糧中添加甜菜堿能夠一定程度上阻止LPS刺激對仔鵝血清中白蛋白含量的降低作用。

表6 甜菜堿對LPS刺激仔鵝血清生化指標的影響

續表6項目Items21日齡 21 days of age總蛋白TP/(g/L)白蛋白ALB/(g/L)球蛋白GLO/(g/L)白球比 A/G28日齡 28 days of age總蛋白TP/(g/L)白蛋白ALB/(g/L)球蛋白GLO/(g/L)白球比 A/GP值 P-value脂多糖 LPS0.4110.0120.045<0.0010.0660.8530.0550.105甜菜堿 Bet0.4080.1230.6180.3980.7140.7090.5720.637互作效應 Interaction0.2830.0190.6320.0620.1530.8990.1330.301

2.4 甜菜堿對LPS刺激仔鵝脾臟炎性因子mRNA相對表達量的影響

如圖1所示，21日齡時，LPS刺激顯著提高仔鵝脾臟IL-1βmRNA相對表達量(P≤0.05)，而添加甜菜堿顯著降低脾臟IL-1βmRNA相對表達量(P≤0.05)。28日齡時，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝脾臟炎癥因子mRNA相對表達量均無顯著影響(P>0.05)。

圖1 甜菜堿對LPS刺激仔鵝脾臟炎性因子mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 甜菜堿對LPS刺激仔鵝生長性能的影響

LPS是革蘭氏陰性細菌的主要致病性因子，由脂質A、核心多糖及O抗原3部分組成[18]。腹腔或肌肉注射LPS是目前構建動物免疫應激模型最常用的方式。免疫應激使機體產生全身炎性反應，引發食欲減退、采食量下降、嗜睡等生理和行為的變化[19]，進而導致生長性能下降。Liu等[20]在肉仔雞12、14、33和35日齡分別腹腔注射0.5 mg/kg BW的LPS，發現LPS刺激對肉仔雞1～21日齡、22～42日齡及1～42日齡ADG和ADFI均有不良影響。本試驗中，LPS刺激顯著降低了仔鵝21日齡體重和16～21日齡ADFI、ADG，提高了16～21日齡F/G，這與前人在肉雞方面的研究結果[21-22]類似，同時提示本次免疫應激模型構建成功。甜菜堿作為有效飼料添加劑，具有促生長、改善胴體組成及提高肉品質的作用[23]。Liu等[24]試驗表明，飼糧中添加0.05%、0.10%、0.20%甜菜堿可以減輕熱應激對黃羽肉雞采食量和體重的不利影響，且存在劑量效應。Hamidi等[25]報道，飼糧中添加0.12%甜菜堿能顯著提高混合球蟲感染肉雞的ADG，可能與甜菜堿對腸道上皮細胞和腸道黏膜的保護作用有關。Wang等[26]研究表明，飼糧中添加甜菜堿通過增強腸組織功能、降低腹瀉率、促進營養物質消化來改善斷奶仔豬的生長性能。本試驗研究發現，在應激期，飼糧中添加甜菜堿具有提高21日齡體重和ADFI的趨勢，LPS刺激和添加甜菜堿對仔鵝21日齡體重有互作效應趨勢，對ADFI有顯著互作效應，表明甜菜堿能緩解LPS刺激對仔鵝生長性能的影響，其原因可能與甜菜堿具有誘食性進而提高了采食量有關。

3.2 甜菜堿對LPS刺激仔鵝器官指數的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽的主要免疫器官，這3個器官的指數是評價家禽免疫狀況的重要指標[27]。胸腺是細胞免疫的重要器官，脾臟是產生抗體、補體等免疫物質的最大免疫器官，法氏囊是家禽特有的體液免疫器官。本試驗中，LPS刺激導致21日齡仔鵝胸腺指數顯著下降，這與孫驍等[28]報道仔豬LPS刺激的結果一致。研究表明，胸腺萎縮與胸腺細胞凋亡有關，胸腺組織和胸腺組織中的淋巴細胞同時隨著年齡增長而減少[29]。而飼糧中添加甜菜堿緩解了LPS刺激對仔鵝胸腺的不利影響，表明甜菜堿可以增強仔鵝的免疫功能，可能與甜菜堿提供甲基、促進蛋白質合成，進而促進細胞生長有關[30]。安立龍等[31]報道，飼糧中添加0.1%甜菜堿可以減弱熱應激對肉雞胸腺、脾臟組織的損傷作用，保護組織結構的完整性。酒精性肝損傷模型試驗中，甜菜堿主要通過降低炎性因子表達、減少脂質過氧化及預防細胞凋亡來發揮護肝功能[32-33]。

3.3 甜菜堿對LPS刺激仔鵝血清生化指標的影響

血清中某些成分變化在一定程度上可以反映動物機體的生理狀態。血清總蛋白來自肝臟合成和腸道吸收，主要包括白蛋白和球蛋白。白蛋白是血清總蛋白的主要蛋白質成分，可維持血漿膠體滲透壓，在體內代謝物質的運輸、營養和組織修復等方面都起著重要的作用[34]，球蛋白由機體免疫器官產生，反映機體免疫力，當機體受到病原體攻擊時，免疫系統就會增加球蛋白的產生。本試驗中，LPS刺激導致21日齡仔鵝血清白蛋白含量顯著降低，球蛋白含量顯著升高，白球比顯著降低，表明機體受到應激，產生炎癥反應。而LPS刺激與添加甜菜堿對血清白蛋白含量存在顯著互作效應，說明飼糧中添加甜菜堿能夠一定程度上阻止LPS刺激對血清白蛋白含量的降低作用，添加甜菜堿有利于白蛋白合成，提高對組織損傷的修復作用。Remus等[35]提出飼糧中添加甜菜堿對血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量具有改善作用，主要與甜菜堿能提供甲基、促進蛋白質合成有關。Yang[36]等研究同樣表明，飼糧中添加0.06%甜菜堿可以提高仔鵝血清總蛋白含量。然而Ghasemi等[37]研究發現，飼糧中添加1%甜菜堿對飼喂不同蛋白質水平的熱應激肉雞血清總蛋白含量沒有顯著影響，但可以提高抗新城疫和傳染性支氣管炎病毒的抗體滴度。

3.4 甜菜堿對LPS刺激仔鵝炎性細胞因子表達的影響

天然免疫是機體抵抗病原微生物侵襲的第1道防線，研究表明，LPS是活化機體免疫系統中巨噬細胞(先天免疫細胞)的有效誘導物，促使炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的合成與分泌，引發炎癥反應[38]。Li等[39]通過體外試驗證明，LPS攻毒小鼠巨噬細胞后炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和趨化因子等mRNA相對表達量顯著上升。本試驗中，LPS刺激顯著提高21日齡仔鵝脾臟IL-1βmRNA相對表達量，對IL-6 mRNA相對表達量有增加趨勢。Li等[40]和Shen等[41]在LPS刺激肉雞試驗中也觀察到類似結果。本研究發現，飼糧中添加甜菜堿顯著降低21日齡仔鵝脾臟IL-1βmRNA相對表達量。IL-1β在機體應對感染和炎癥損傷中具有重要作用，IL-1β是NF-κB下游基因之一。Xia等[42]指出，甜菜堿可抑制NF-κB的活化從而降低IL-1β的表達。Zhang等[43]研究發現，甜菜堿降低炎性因子IL-6 mRNA相對表達量與抑制其啟動子區域的甲基化有關。TGF-β是重要的抗炎因子，具有促進細胞生長、分化和免疫調節作用，LPS刺激和添加甜菜堿對TGF-βmRNA相對表達量都沒有顯著影響。

4 結 論

LPS刺激降低仔鵝生長性能和免疫性能，而飼糧中添加0.06%甜菜堿可以改善仔鵝生長性能，提高胸腺指數，降低脾臟促炎因子IL-1βmRNA相對表達量，從而在一定程度上緩解LPS刺激對仔鵝的負面影響。甜菜堿對LPS刺激應激期的緩解作用比恢復期更為明顯。