亞急性瘤胃酸中毒對綿羊瘤胃異常代謝產(chǎn)物、瘤胃菌群和血液相關指標的影響

韓郭皓 高曉莎 段晉偉 張慧琴 鄭 巖 馬林峰 何金鑫 霍乃蕊 裴彩霞 古少鵬*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，太谷 2030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 2030801)

亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)是高產(chǎn)反芻動物群體中常見的營養(yǎng)代謝性疾病，綿羊育肥養(yǎng)殖過程中，為達最大生產(chǎn)性能常飼喂大量高精飼糧，高精飼糧發(fā)酵導致瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸以及乳酸等有機酸積累，瘤胃pH長時間處于較低水平，綿羊發(fā)生SARA[1]。SARA會導致瘤胃液pH下降、瘤胃微生物菌群紊亂、機體組織器官產(chǎn)生炎癥、生產(chǎn)性能降低、動物淘汰或死亡等情況發(fā)生[2-4]。SARA早期通常沒有典型癥狀，診斷較為困難，瘤胃液pH 5.2～5.6持續(xù)3 h以上為SARA主要判定依據(jù)[5]。SARA發(fā)生機制包括乳酸中毒學說以及內(nèi)毒素組胺中毒學說[6]。研究報道，奶牛SARA可引起瘤胃液乳酸、組胺和內(nèi)毒素含量顯著增加，但血液乳酸、組胺和內(nèi)毒素含量變化不顯著[7-8]；而曾光[9]通過梯度增加精粗比誘導山羊SARA，發(fā)現(xiàn)瘤胃液及血液乳酸、組胺和內(nèi)毒素含量均顯著升高。瘤胃內(nèi)環(huán)境失衡通常會導致瘤胃菌群發(fā)生改變，Kim等[10]飼喂高谷物飼糧誘導奶牛SARA，顯示瘤胃菌群多樣性指數(shù)下降，普雷沃氏菌屬的相對豐度降低。目前，關于SARA的發(fā)生及其機制研究多集中于奶牛[11-13]和山羊[14-16]，模型多以短期高谷物飼糧誘導，誘導過程與疾病發(fā)生發(fā)展不符，SARA綿羊瘤胃異常代謝產(chǎn)物及菌群、血氣和血清生化指標等如何變化鮮有報道，其發(fā)生機制尚不清楚。因此，本研究通過逐步提升飼糧精粗比建立綿羊SARA模型，分析SARA對綿羊瘤胃異常代謝產(chǎn)物、瘤胃菌群、血氣和血清生化指標的影響，探究綿羊SARA狀態(tài)下瘤胃內(nèi)環(huán)境和機體狀況，為防治綿羊SARA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1.2 動物設計

試驗前綿羊分為2組，分別為SARA誘導組(n=35)與對照組(CK組，n=15)。預試期30 d，飼喂精粗比為50∶50的基礎飼糧。SARA誘導組通過飼糧精粗比遞增誘導綿羊發(fā)生SARA，飼糧精粗比依次為50∶50、70∶30、80∶20、90∶10和100∶0，各精粗比飼糧均飼喂7 d，瘤胃液pH 5.2～5.6持續(xù)3 h以上的綿羊構(gòu)成SARA模型組；CK組飼喂精粗比為50∶50的基礎飼糧。每日06：00和17：00飼喂，每只羊每日約采食1.55 kg飼糧。飼糧參照《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)配制，各精粗比飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 各精粗比飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items精粗比 Concentrate to forage ratio50∶5070∶3080∶2090∶10100∶0鈣 Ca0.560.520.490.470.45磷 P0.230.240.260.250.26鈣磷比 Ca/P2.432.171.881.881.65

1.3 臨床觀察與樣品采集測定

1.3.1 臨床觀察

每日觀察綿羊精神和糞便狀態(tài)，采集瘤胃液時觀察其顏色、氣味和黏稠度，并記錄。

1.3.2 樣品采集

于各飼喂期第7天晨飼后1、2、3、4、5、6和8 h使用瘤胃液口腔采樣器(A1164K，武漢科立博牧業(yè)科技有限公司)抽取瘤胃液，每只50 mL，4層紗布過濾保存。模型構(gòu)建成功后，于晨飼前用BD PresetTM采血器和含促凝劑的采血管采集頸靜脈血液。

1.3.3 樣品測定

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)使用Qiime 1.9.1軟件進行處理分析。有效測序數(shù)據(jù)以97%的一致性聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，使用SILVA 132數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。Alpha分析使用wilcox秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)使用Excel 2019整理，統(tǒng)計分析應用SPSS 26.0軟件中獨立樣本t檢驗及單因素方差分析，多重比較采用Duncan氏法。數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 SARA綿羊模型建立

由表2可見，SARA誘導組瘤胃液pH隨飼糧精粗比提高而降低，精粗比為100∶0時共有27只綿羊瘤胃液pH在5.2～5.6持續(xù)3 h以上。臨床觀察，CK組綿羊未見明顯異常，瘤胃液較稀薄，氣味微臭，色澤偏綠(圖1-A)，糞便為較硬顆粒狀(圖1-C)；SARA誘導組在精粗比為100∶0時部分綿羊瘤胃液較濃稠，氣味惡臭，色澤偏黃(圖1-B)，輕度腹瀉，糞便稀軟不成形(圖1-D)，精神狀態(tài)未見明顯異常。綜上判定，SARA誘導組的27只綿羊在精粗比為100∶0時發(fā)生SARA，構(gòu)成SARA模型組[5]。

A：健康綿羊瘤胃液 rumen fluid of healthy sheep；B：SARA綿羊瘤胃液 rumen fluid of SARA sheep；C：健康綿羊糞便 feces of healthy sheep；D：SARA綿羊糞便 feces of SARA sheep。

表2 SARA對綿羊瘤胃液pH的影響

2.2 SARA對綿羊瘤胃液乳酸、組胺和內(nèi)毒素含量的影響

由表3可見，瘤胃液乳酸、組胺和內(nèi)毒素含量隨飼糧精粗比提高而增加，SARA模型組瘤胃液乳酸、組胺和內(nèi)毒素含量均顯著高于CK組(P<0.05)。

表3 SARA對綿羊瘤胃液乳酸、組胺和內(nèi)毒素含量的影響

2.3 SARA對綿羊瘤胃菌群的影響

2.3.1 Alpha多樣性分析

由表4可見，隨飼糧精粗比提高，瘤胃菌群豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))下降。SARA模型組Chao1指數(shù)顯著低于CK組(P<0.05)。

表4 SARA對綿羊瘤胃菌群Alpha多樣性的影響

2.3.2 Beta多樣性分析

非度量多維標度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析基于Weighted Unifrac距離，SARA模型組位于第1及第4象限，與CK組距離較遠(圖2-A)；主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)基于Bray Curtis距離，獲得主坐標1(PC1)的貢獻率為17.14%，SARA模型組位于第4象限，樣本較為集中，與CK組距離較遠(圖2-B)。

A：非度量多維標度分析 NMDS analysis；B：主坐標分析 PCoA。

2.3.3 門水平與屬水平下瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析

門水平下，SARA誘導組在精粗比為90∶10時最優(yōu)菌門為厚壁菌門(Firmicutes)，其余各組最優(yōu)菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)；與CK組相比，SARA模型組厚壁菌門、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度降低(圖3-A)。屬水平下，SARA誘導組在精粗比為90∶10時最優(yōu)菌屬為Pseudoscardovia，其余各組最優(yōu)菌屬為普雷沃氏菌科未確定菌屬(unidentified Prevotellaceae)；與CK組相比，SARA模型組普雷沃氏菌科未確定菌屬、羅氏菌屬(Roseburia)和Pseudoscardovia相對豐度增加(圖3-B)。SARA模型組在屬水平下，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和Pseudoscardovia為具有生物學及統(tǒng)計學意義的差異物種(圖3-C)。

A：門水平菌群結(jié)構(gòu)堆積柱狀圖 stacking histogram of bacterial community structure at phylum level；B：屬水平菌群結(jié)構(gòu)堆積柱狀圖 stacking histogram of bacterial community structure at genus level；C：線性判別分析分枝進化圖 LEfSe analysis branching evolution diagram。

2.3.4 Tax4Fun功能預測

由圖4可見，SARA模型組瘤胃菌群代謝相關二級功能層基因富集存在差異，與CK組相比，主要體現(xiàn)在碳水化合物代謝相關基因的相對豐度升高，輔助因子和維生素的代謝、脂質(zhì)代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成和其他氨基酸的代謝相關基因的相對豐度降低。

圖4 代謝相關功能基因預測熱圖

2.4 SARA對綿羊血氣分析的影響

由表5可見，血氣分析結(jié)果顯示，SARA模型組血液乳酸含量顯著高于CK組(P<0.05)，SARA模型組血液二氧化碳總量、實際碳酸氫鹽及全血堿剩余含量均顯著低于CK組(P<0.05)。

表5 SARA對綿羊血氣分析的影響

2.5 SARA對綿羊血清生化指標的影響

由表6可見，SARA模型組血清組胺和內(nèi)毒素含量顯著高于CK組(P<0.05)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于CK組(P<0.05)，其余血清生化指標與CK組差異不顯著(P>0.05)。

表6 SARA對綿羊血清生化指標的影響

3 討 論

瘤胃pH受飼糧影響，一般情況下，反芻動物瘤胃pH維持在6.5～7.5[17]。瘤胃菌群變化與飼糧組成、飼養(yǎng)環(huán)境和管理模式等相關[18-19]。動物長期采食高精料飼糧，瘤胃異常發(fā)酵，導致瘤胃pH下降，瘤胃菌群改變[20]。Plaizier等[21]誘導奶牛SARA，發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物區(qū)系豐富度和多樣性降低。眾多研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物瘤胃最優(yōu)菌門為擬桿菌門，最優(yōu)菌屬為普雷沃氏菌屬[22-27]。李小玉等[27]研究急性瘤胃酸中毒山羊，發(fā)現(xiàn)瘤胃厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度降低。研究表明，SARA奶牛普雷沃氏菌屬相對豐度提升[28]，瘤胃壁菌群碳水化合物代謝相關基因高表達[29]。本研究與上述結(jié)果相似，瘤胃內(nèi)酸性環(huán)境導致瘤胃菌群發(fā)生變化，大量瘤胃細菌因不適酸性環(huán)境而死亡，進而菌群豐富度和多樣性降低，造成瘤胃健康破壞和生產(chǎn)效能降低[30]。SARA模型組瘤胃厚壁菌門相對豐度增加，主要為降解纖維類物質(zhì)和碳水化合物的菌種，進而引起菌群碳水化合物相關代謝基因富集，有助于反芻動物瘤胃代謝[24]。綿羊發(fā)生SARA后，瘤胃內(nèi)毒素含量顯著升高，因擬桿菌門內(nèi)革蘭氏陰性細菌大量死亡，擬桿菌門相對豐度降低，細菌裂解釋放內(nèi)毒素[25]。羅氏菌屬相對豐度提升，瘤胃液乳酸含量顯著增加，表明SARA會增加瘤胃乳酸產(chǎn)生菌，導致瘤胃乳酸積累，pH下降。

SARA模型組血氣分析結(jié)果與胡紅蓮[14]和苑學[31]研究結(jié)果一致，血液pH、二氧化碳分壓、實際碳酸氫鹽和全血堿剩余含量降低，氧分壓含量升高。SARA綿羊血液乳酸含量顯著升高，表明瘤胃液乳酸吸收超過肝臟處理能力，導致血液pH下降，血液過多的氫離子(H+)由血液實際碳酸氫鹽緩沖，進而降低機體堿儲，發(fā)生代謝性酸中毒。SARA模型組瘤胃內(nèi)毒素積累，促進炎癥介質(zhì)組胺的產(chǎn)生，二者同時進入血液循環(huán)，血液與瘤胃液內(nèi)毒素和組胺含量顯著升高，可能會引發(fā)一系列炎癥反應[32]。血清生化指標可以反映機體營養(yǎng)代謝狀況以及肝腎功能狀況。孫燕勇等[33]研究發(fā)現(xiàn)，SARA山羊有一定程度的肝功能損傷，本研究未發(fā)現(xiàn)肝臟損害，各項血清生化指標均處于正常范圍，可能與SARA持續(xù)時間有關。

4 結(jié) 論

本研究通過逐步遞增飼糧精粗比成功構(gòu)建綿羊SARA模型。綿羊發(fā)生SARA時，瘤胃內(nèi)環(huán)境改變，瘤胃菌群豐富度降低，厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、普雷沃氏菌科未確定菌屬、羅氏菌屬和Pseudoscardovia相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度下降，血液和瘤胃液乳酸、內(nèi)毒素和組胺含量升高，機體堿儲降低，發(fā)生代謝性酸中毒。

致謝：

感謝山西保森畜牧有限公司提供的試驗場地。